201352. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 4-(2,3-epoxi-propoxi)-fenil-ecetsav és 4-(2-hidroxi-3- -/izopropil-amino/-propoxi-fenil-ecetsav észterei, valamint 4-(2-hidroxi-3-/izopropil-amino/-propoxi)-fenil-acetamid sztereospecifikus előállítására
3 HU 201352 B 4 -propoxi-fenil-ecetsav-észter ezután izopropil-aminnal reagáltatható, és igy a megfelelő 4- [2-hidroxi-3-(izopropil-amino)-propoxi)-fenil-ecetsav-észtert kapjuk, amelyet ezután ammóniával reagáltatva amidálunk, és így az 5- konfigurációjú atenololt kapjuk. Az igy kapott atenololt azután, kívánt esetben, átalakíthatjuk gyógyászatilag megfelelő sókká a szakirodalomban ismert eljárások szerint valamilyen, megfelelő sav segítségével. Az eljárás kivitelezése előnyösen úgy történik, hogy olyan, megfelelő mikroorganizmust alkalmazunk, amely hatására az atenolol lagalább 70%-ban, előnyösen legalább 80%-ban, még előnyösebben legalább 90%-ban S konfigurációjú lesz, A .sztereoszelektív epoxidáló hatású mikroorganizmus' kifejezés baktériumokat, élesztő- és egyéb gombákat jelent. Megfelelően alkalmazható baktériumok a Pseudomonas oleovorans mikroorganizmusok. Azok a mikroorganizmusok amelyek új, genetikus anyagok beépítésével nyerik sztereoszelektiv epoxidáló képességüket, úgy állíthatók elő, hogy olyan klónozott gént, amely képes polipeptid, pl. enzim sztereoszelektiv epoxidáló hatású kódolására, átteszünk egy megfelelő mikroorganizmusból egy másikba, elsősorban Escherichia coliba. Egyéb törzsekhez tartozó mikroorganizmusokat is alkalmazhatunk, ezek képviselői, pl. a Pseudomonas, Mycobatérium, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Bacillus, Nocardia, Rhodococcus, Escherichia és a Corynebacterium baktériumok. A klónozott gének kiválasztása aszerint történhet, hogy képesek legyenek a 4-(allil-oxi)-fenil-ecetsav-észterek sztereo-epoxidáló átalakítását végző enzim kódolására. A klónozott gének kiválasztása történhet egy, már kiválasztott génnel való kereszt-hibridizálással is úgy, hogy egy enzimet sztereo-szelektiv epoxidáló hatásúra kódolunk. A mikroorganizmusokat előnyösen pl. valamilyen polimer gélen lekötjük. Ez történhet élő sejtekkel, elhalt sejtekkel és/vagy nyugvó sejtekkel, vagy megfelelő, ezekből származó enzimekkel. Az enzimeket bizonyos mértékig tisztíthatjuk is, abban az esetben, ha specifikus, nagyobb aktivitás szükséges. Ennek megfelelően a .mikroorganizmusok vagy az ebből származó anyagok' kifejezés élő, elhalt vagy nyugvó mikroorganizmusokra vagy extraktumaikra, adott esetben koncentrált és/vagy tisztított formáikra vonatkozik. Például adott esetben mesterséges vagy természetes kofaktorokkal kombinált enzimek is alkalmazhatók. A 4-allil-oxi-fenil-ecetsav-észterek epoxidálására olyan sejtek is alkalmazhatók, amelyeknek nincs fermentáló hatásuk. Azt tapasztaltuk, hogy megfelelő körülmények között, élő vagy elhalt sejtekből származó enzimek hatására a kívánt S-izomer képződik. A mikroorganizmusok vagy a belőlük származó anyagok többször alkalmazhatók, és általában legalább két hétig hatásosak. A mikroorganizmusok még koszubsztrátum (pl. glükóz) nélkül is aktívak maradhatnak. A 4- -(2,3-epoxi-propoxi)-fenil-ecetsav-észter S- izomer dúsítása megfelelő puffer, valamint fiziológiás sóoldatban megy végbe. Azt tapasztaltuk, hogy a provokált sejtek tárolás után is közvetlenül képesek az S-izomerben dús termék képezésére. A 4-(allil-oxi)-fenil-ecetsav-észterek epoxidáldására alkalmasak a Pseudomonas oleovorans fajták (egy ehhez a fajtához tartozó törzset az ATCC-nél letétbe helyeztek a 29 347 letéti számon 1976. június 21-én) vagy ezek változatai vagy mutánsai. A találmányunk szerinti ejárás gyakorlati alkalmazásánál olyan, az előzőekben említett 0,5-10 napig tenyészthető mikroorganizmust választunk, amely képes 4-(allil-oxi)-fenil-ecetsav-észterekból kiindulva 4-(2,3-epoxi-propoxi)-fenil-ecetsav-észterek képzésére úgy, hogy a kapott termékben az S-konfigurációjú vegyület legalább 70%, előnyösen legalább 80%, még előnyösebben legalább 90% legyen. Az alkalmazandó sejteket szuszpendálhatjuk folyékony tópközegben, és a 4-(allil-oxi)-fenil-ecetsav-észtert az igy készített sejtek hatásának tesszük ki. A másik megoldás, hogy elpusztított sejteket pl. lizáló közegben szuszpendálunk, és a 4-(allil-oxi)-fenil-ecetsav-észtert a sejtekből származó anyagok hatásának tesszük ki. Az 0,5-10 napon keresztül tenyésztett sejteket a folyékony tápközegben vagy a lizáló közegben való szuszpendálás előtt elválaszthatjuk a tenyészetből. A 4-(allil-oxi)-fenil-ecetsav-észter sztereoszelektív epoxidálására alkalmas mikroorganizmusok szaporodásához alkalmazhatunk olyan, szokásosan alkalmazott tenyészközeget, amely valamilyen, asszimilálható szénforrást, pl. glükózt, glicerint, tejcukrot, szénhidrogéneket, igy hexánt, stb. valamilyen nitrogénforrést, pl. ammónium-szulfátot, ammónium-nitrátot, ammónium-kloridot és valamilyen szervetlen tápforrást, pl. nyomnyi mennyiségű foszfátot, magnéziumot, káliumot, cinket, vasat és egyéb fémeket tartalmaz. Előnyösen alkalmazható olyan PSX közeg, amely adott esetben egyéb adalékanyagot is tartalmaz. Adott esetben valamilyen indukálószer, pl. dietoxi-metán is adható a tenyészkozeghez. A mikroorganizmusok szaporodásához előnyösen 0-45 °C hőmérséklet és 3,5-9 pH szükséges. A mikroorganizmusok szaporodása előnyösen 20-37 °C-on és 5-7 pH érték mellett történik. A mikroorganizmusok szaporodásához levegőztetés szükséges. Bármely olyan, bevált eljárás megfelel, amelyben a mikroorganizmusok anyagcseréjéhez elegendő oxigén áll rendelkezésre. A legmegfelelőbb oxigénforrás a levegő. A 4-allil-oxi-fenil-ecetsav-észter 4- -(2,3-epoxi-propoxi)-feni l-ecetsav-észterré történő konverziójához a mikroorganizmuso-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
