201350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazmidok stabilizálására
27 HU 201350 B SZABADALMI IGÉNYPONTOK 28 A plazmid stabilitását úgy határoztuk meg, hogy pOU 91-et tartalmazó sejteket (é6 kontrollként a pOU 82-t tartalmazó sejteket) McConkey lemezeken, szelekciós kényszer nélkül, 30 °C hómérsékleten 25 generáción át növesztettünk; a pOU 91-el transzformált sejtek vörös telepeket képeznek (Lac*), mig a pOU 82-vel transzformált sejtek mind vörös, mind fehér telepeket képeznek, jelezve, hogy a szelekciómentes periódus során a pOU 82 elveszett jónéhány sejtből. Az E. coli CSH/pOU91 törzset 2483. szómon helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben. 10. példa par A.*, par B* mini-Rl plazmid megalkotása pOU 82 plazmidot (8. példa) hasítottunk EcoRl-el, és a pOU43-ból (lásd 7. példa és 13. ábra) származó, a par A területet hordozó EcoRl fragraenst iktattuk bele. Ebből az EcoRl fragmensből töröltünk legalább 500 bázispárt, beleértve egy EcoRl helyet is, Bal 31 exonukleáz segítségével. A plazmid egyedüli EcoRl helyére a pOU13-ból (lásd 4. példa és 9. ábra) származó EcoRl fragmenst iktattuk be. A keletkezett plazmid, amely egy Par A*, Par B* fenotípust hordoz, ezután transzformálható olyan E. coli CSH 50 törzsbe, amely már pOU94-et hordoz, és kiválogatható lényegileg ugyanolyan módszerrel, mint a 4. példában, azzal a különbséggel, hogy a pOU82 származék gyenge Lac* fenotipust közvetít, ami azt jelenti, hogy az ezt a plazmidot befogadó sejtek telepei csak a középen lesznek vörösek és a szélén színtelenek, amikor McConkey laktóz-indikátor lemezeken nőnek. 11. példa par A+, par B+ mini-Rl-plazmid létrehozása pOU61 plazmidot (lásd 5. példa) hasítottunk EcoRl-el, és a par A területet hordozó pOU43-ból eredő EcoRl fragmenst iktattuk bele, majd ligáltuk. Az így nyert plazmidot, amely Par A*, Par B* fenotípust közvetít, lehet azután transzformálni E. coli CSH 50 törzsbe, amely mér hordoz pOU2 plazmidot, és ilyen módon lehet válogatni a 4. példában leirt módszer szerint. A kívánt plazmidot befogadó sejtek telepei színtelen telepekként (Lac) mutatkoznak McConkey laktóz lemezeken. Megjegyzés. A jelen leírásban és igénypontokban, ahol külön nem jelezzük a par", Par*, par* vagy Par* jeleket, a par és Par kifejezés a megosztási funkció kifejeződését jelenti. 1. Eljárás örökletesen instabil plazmidok stabilizálására, azzal jellemezve, hogy a stabilizálandó plazmidba egy olyan DNS fragmentumot iktatunk be, amely magéban foglalja az RÍ plazmid EcoRl-A fragmentumát vagy annak egy rövidebb fragmentumát, amely egy RÍ par területet tartalmaz. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy RÍ par A területet, RÍ par B területet vagy RÍ par A és RÍ par B területet tartalmazó DNS fragmentumot alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.) 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan, RÍ par A és RÍ par B területet tartalmazó DNS fragmentumot alkalmazunk, amelynek hossza legfeljebb 6 kb, előnyösen legfeljebb 4 kb, különösen legfeljebb 3 kb. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.) 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan, RÍ par A területet tartalmazó DNS fragmentumot alkalmazunk, amelynek hossza legfeljebb 4 kb, előnyösen legfeljebb 2,5 kb, különösen legfeljebb 1 kb, (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.) 5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan RÍ par B területet tartalmazó DNS fragmentumot alkalmazunk, amelynek hossza legfeljebb 2 kb, előnyösen legfeljebb 1,5 kb, különösen legfeljebb 1 kb. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.) 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmidként pl5 plazmidot vagy egy származékát vagy egy nagy kópiaszámú, széles gazdaszervezet tartományú plazmidot vagy annak származékát alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.) 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmidként pMBl plazmidot vagy annak származékát, előnyösen pBR322 plazmidot vagy annak származékát alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.) 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmidként IncFII összeférhetetlenségi csoportba tartozó plazmidokat, beleértve az Rl-et és származékait, F plazmidot vagy származékait vagy kis kópiaszámú, széles gazdaszervezet tartományú plazmidokat vagy származékaikat használjuk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.) 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazraidként egy vagy több, a plazmiddal természet szerint nem-rokon gént tartalmazó plazmidot alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.) 10. Eljárás pOUl, pOU71-184, pOU2, pOUlO, pOU13, pOU14, pOU61, pOU12, pOU45, pOU47 és pOU472 stabilizált plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy a) pOUl plazmid előállítására pKN184 plazmidot tartalmazó E. coli sejteket b211 : : Tn5 bakteriofág szuszpenzióval fertőzünk, és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 16
