201350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazmidok stabilizálására
25 HU 201350 B 26 tottunk, majd ligáltuk, és E. coli CSH 50 törzsbe transzformáltuk ampicillin rezisztens telepekre szelektálva McConkey laktóz indikátorlemezeken. Néhányat ezek közül a Lac* kiónok közül a Lac* fenotípus stabil Öröklődésére McConkey lemezeken átvizsgáltunk, ahogyan ezt az Anyagok és módszerek fejezetben leírtuk. A stabilan öröklődő plazmidokat az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképeztük (lásd 12. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy ezek a pOUl-nek azt a Sal I fragmensét hordozzák, amelyen a par B terület elhelyezkedik. A pF 1403-11-et és a pOUl-ból származó Sal I fragmenst tartalmazó plazmidot pOU 12-nek neveztük. Ennek mérete 16 kb és fenotipusa a következő: Par B*, Lac*, ApR. A pOU 12 stabilan öröklődik kevesebb, mint 5 • 10'5- /sejt/generáció LF értékkel. Az E. coli CSH 50/pOU12 törzset 2715 számon helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben. 7. példa A pl5 plazmid stabilizálása par A fragmenssel pMC 903 plazmidot (Casadaban és munkatársai: J. Bact. 143, 1980, 971. oldal) hasítottunk EcoRl-el, és a pOU43 plazmidból (13. ábra; 2720. DSM szám) származó, a par A területet hordozó EcoRl fragmenst iktattuk bele, majd ligáltuk, és az E. coli CSH 50 törzsbe transzformáltuk. Az igy létrejött plazmidot pOU 45-nek jelöltük, ennek mérete 13,4 kb és fenotipusa a következő: Par A*, Lac', ApE, Km*. A plazmidot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképeztük (lásd 14. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a par A terület beiktatódott a lac operonba, amely ez által inaktiválódott. Amikor az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetett módon stabilitásra vizsgáltunk, a plazmidot stabilan öröklődőnek találtuk 8 ■ 10-4/sejt/generáció LF értékkel, míg a pMC 903 LF értéke 1%/sejt/generáció. Az E. coH CSH 50/pOU45 törzset 2721 számmal helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben. 8. példa Mini-RÍ plazmid stabilizálása par A területtel A pOU43-ból származó EcoRl fragmenst beiktattuk a pOU82 mini-Rl plazmidba (DSM száma 2482), amely tartalmazza az RÍ plazmid alap-replikonját, az EdA4-fágból eredő vX.Ph promotort és cl represszor gént, a ß-laktamázt kódoló gént a Tn 3 transzpozonból, a pVH 1424-ből a deo-promotort és a lac Z gén amino-terminális végét, továbbá a pSKS 104- -ből a lac operon maradványát (a pOU82 konstrukciójának részletes leírása megtalálható a bejelentőknek a jelen bejelentéssel összefüggő bejelentésével, amelynek címe: Plazmidok feltételesen szabályozatlan replikációs viselkedéssel; és amelyet ugyanazon a napon nyújtottak be, mint a jelen bejelentést). A pOU82 plazmid hordozza az ApB és Lac* fenotípust és van egy egyedi EcoRl helye, amely használható ez EcoRl fragmensek klónozásához. Ez a plazmid 1%/generéció frekvenciával vész el szelekciós kényszer távollétében. A plazmidot, amelyben 2,4 kb-s EcoRl fragmenst iktattunk be azonos orientációban, pOU47-nek jelöltük. A plazmid mérete 14 kb és fenotipusa a következő: Par A*, Lac*, Ap8. A pOU47-et az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképeztük (lásd 15. ábra). Az E. coli CSH 50/pOU47 törzset 2722 számon helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben. A par A területet hordozó EcoRl fragmenst tovább csökkentettük 400 bp-vel a Bal 31 exonukleáz segítségével; a törlést az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak alapján hajtottuk végre, pOU47 egyedüli BamHI helyét hasznosítva. Az igy megalkotott plazmidot pOU472-vel jelöltük. A plazmid 13 kb méretű és fenotipusa a következő: Par A*, Lac*, ApB. A pOU472-t az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképeztük (lásd 16. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy a pOU472 hordozza a Bal 31 deléció által létrehozott 2,0 kb-s EcoRl fragmenst. Amikor az Anyagok és módszerek fejezet szerint stabilitásra vizsgáltunk, a plazmidot stabilan öröklődőnek találtuk, amely azt jelenti, hogy a teljes par A területet tartalmazza a 2,0 kb nagyságú EcoRl fragmens. Az E. coli CSH 50/pOU472 törzset 2726. számon helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben. 9. példa par A területet hordozó mini RÍ plazmid létrehozása pOU 90 plazmidot (lásd 5. példa) BamHI-vel és részlegesen Sau 3A-val elhasítottuk, hogy kitöröltük az EcoRl-A fragmens egy részét, a nagyobb 6 kb-s rész visszamaradt, majd ligáltuk. Az igy nyert pOU91 plazmidot E. coli CSH 50 törzsbe transzformáltuk. A pOU 91 mérete 18,75 kb, fenotipusa a következő: Par*, Ap8, Lac*. A plazmidot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképeztük (17. ábra). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
