201350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazmidok stabilizálására
23 HU 201350 B 24 McConkey laktóz lemezen és stabil öröklődés szelekciós kényszer tévollétében - klón elemzése azt mutatja, hogy a Pst I-D fragmens (lásd 1. ábra) közvetíti ezt a fenotipust. Más Pst I fragmens egyedül nem volt képes stabilizálni a pJL 124-et. A pJL 124 stabilizálásáért felelős területet, amely egy 1,8 kb-s Pst I fragmensen belül helyezkedik el, par B-vel jelöljük. Abból a célból, hogy tovább elemezzük a Pst I-D fragmenst, a fragmenst egy pBR 322 plazmid bla-génjében levő egyedüli Pst I helyre klónoztuk, amely a pOU 93-at eredményezi (lásd 7. ábra; a plazmidot 2724 számmal helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben). Ennek a plazroidnak a restrikciós térképezése azt mutatja, hogy a Pst I-D fragmens három Rsa I helyet tartalmaz (lásd 6. ábra). Az Rsa I tompa végeket alakít ki, ezért a 900 bp-s Rsa I fragmenst a következő módon iktattuk be a pHP34 plazmid (Prentki és munkatársai: Gene, 17, 1982, 189- -96 oldal) Sma I helyére. pOU 93-at hasítottunk Rsa I-el, és összekevertük Sma I-el hasított pHP 34-el, majd ligáltuk. A ligóciós keveréket olyan E. coli CSH 50 törzsbe transzformáltuk, amely már befogadott pOU 94 plazmidot (ez egy pl5 származék, amely fenotipusa szerint Lac* és Par B*; lásd 8. ábra, ezt a plazmidot 2725 számmal helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben), ampicillin rezisztenciára szelektálva 50 wg/ml ampicillint tartalmazó lemezeken. A különböző plazmidokban hordozott par B* területek által kifejezett összeférhetetlenség következtében a pOU 94 elvész, amikor egy másik plazmidot, amely Par B* fenotipusú, bevezetünk az E. coli sejtbe, igy lehetővé válik, hogy a helyes beiktatásokra és transzformánsokra a sejteket McConkey lemezre szélesztve és kiválogatva a színtelen telepeket (Lac-) szelektáljunk. Az egyik ilyen összeférhetetlen pHP 34 plazmidszármazékot, amelyről azt találtuk, hogy tartalmazza a 900 bp-s Rsa I fragmenst, pOU 13-al jelöltük. A plazmid 5,3 kb méretű és fenotípusa a következő: TcB, ApB, Par BL A plazmidot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel főitérképeztük (9. ábra). A térképezés azt mutatja, hogy az Rsa I fragmens átalakult egy 900 pb-s EoRl fragmenssé, mivel a pHP34 Sma 1 helyét a két EcoRl hely szegélyezi. Az E. coli CSH 50/pOU 13 törzset 2716 számon helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben. A pOU13-ból származó 900 bp-s EcoRl fragmenst beiktattuk a pOUlOl EcoRl helyére, amely egy ApB, CmB .megvaduló" mini-Rl származék (a pOUlOl konstrukciójának részletes leírása megtalálható a bejelentőknek a jelen bejelentéssel összefüggő bejelentésében, amelynek cime: Plazmidok feltételesen szabályozatlan replikációs viselkedéssel; és amelyet ugyanazon a napon nyújtottak be, 14 mint a jelen bejelentést) egy egyedi EcoRl hellyel a cat génben (ez a gén kódolja a CmB-t), így alkottuk meg a pOU14 plazmidot, amely 8,2 kb méretű és fenotípusa a kővetkező: Cms, ApB, Par B*. A plazmidot az 1. példában leírt módszer szerint restrikciós enzimekkel feltérképeztük (lásd 10. ábra). A plazmidot stabil öröklődésre megvizsgáltuk a 3.1. példában leírtak szerint, igy demonstráltuk, hogy 30 °C hőmérsékleten a pOU14 stabilan öröklődik kisebb, mint 1 • • 10*4/sejt/generáció LF értékkel, ugyanakkor a pOUlOl 1%/generáció gyakorisággal elvész a sejtekből. Az E. coli CSH 50/pOU14 törzset 2717. számon helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben. 5. példa Mini-Rl plazmidok stabilizálása par B fragmenssel pOU 90 plazmidot - amely a pKN 1562 .megvaduló" replikációs származéka, és amely az RÍ plazmid alapreplikonjét, az ED^4 fágból származó^PR promotort és cls57 represszort, a 0-laktamázt kódoló gént a Tn 3 transzpozonból, valamint a pKN184-ból származó EcoRl-A fragmenst tartalmazza, úgy állítottuk elő, hogy a pOU82-t (DSM 2482) EcoRl-gyal hasítottuk, és ezen a helyen a pKN184 vad típusú par területét tartalmazó EcoRl-A fragmenst iktattuk bele, majd ligáltuk. A pOU90-t Sál I-el elhasítottunk, és ligéltunk a pOU61 plazmidot nyerve. A plazmidot E. coli CSH 50 törzsbe trnszformáltuk, McConkey lemezeken Lac" fenotípusra szelektálva. A pOU61-et az 1. példában leírt módszerrel feltérképeztük (lásd 11. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy a pOU61 hordozza az Eco Rl-A fragmens jobboldali végét, amely a par B területet tartalmazza. A plazmid mérete 10 kb és fenotípusa a következő: Par B*, ApB, Lac”. A plazmidot a 3.1 példában leírtak szerint stabil öröklődésre vizsgáltuk. Azt találtuk, hogy a pOU61 stabilan öröklődik kevesebb, mint 1 • 10-4/sejt/generáció LF értékkel. Az E. coli CSH 50/pOU61 törzset 2723 számmal helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben. 6. példa A pF 1403-11 plazmid stabilizálása a par B fragmenssel A pOUl plazmidot (lásd 1. példa) Sal I-el hasítottuk, és összekevertük pF 1403-11 plazmiddal, amelyet előzőleg Sál I-el elhasi-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
