201350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazmidok stabilizálására
21 HU 201350 B 22 gő bejelentésében, amelynek címe: .Plazmidok feltételesen szabályozatlan replikációs viselkedéssel*, és amelyet ugyanaznap nyújtottak be, mint a jelen bejelentést) - EcoRl-el hasítottunk és a pOUl-ből származó Ecorl-A : : Tn 5 fragmenst (lásd 1. példa) iktattuk bele, ligáltuk, és E. coli CSH 50 törzsbe transzformáltuk, a kanamicin-rezisztens sejteket 50 Mg/ml kanamicint tartalmazó LA lemezeken szelektálva. A transzformánsokat pOU 71 .megvaduló* replikációs fenotipusra 50 Mg/ml kanamicint tartalmazó LA lemezeken szélesztve és 42 °C hómérsékleten inkubálva válogatjuk. Azok a sejtek, amelyek a .megvaduló* replikációs plazmidot tartalmazzák, abbahagyják a növekedést ilyen körülmények között. Ilyen módon a pOU 71-184 plazmidot azonosítottuk, amely 25,5 kb méretű és fenotípusa a következő: Par A*, Par B*, ApB, KmB. A plazmidot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképeztük (lásd 3. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy az EcoRl-A : : Tn 5 fragmens korrektül beiktatódott a pOU 71 plazmid EcoRl helyére. A plazmidot befogadó sejteket LA lemezeken 100 generáción keresztül, szelekciós kényszer nélkül növesztettük, vagyis nem olyan lemezeken növesztve, amely antibiotikumot tartalmaz; amikor az Anyagok és módszerek fejezetben leírt módszer szerint (II. megosztási vizsgálat) meghatároztuk, a sejtekből nem volt megfigyelhető a plazmid elvesztése, mig a pOU 71 a hasonló körülmények között nőtt sejtekből lX/generáció gyakorisággal eltűnt. így meghatározható tehát, hogy a pOU 71-184 stabilan öröklődik mintegy 10~Vsejt/generáció elvesztési gyakorisággal. Az E. coli CSH 50/pOU 71-184 törzset 2763. számon helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben. 2.) pl5 replikon A pJL 124 plazmidot (lásd 2. példa), amely Par" pl5 replikon, Pst I restrikciós enzimmel elhasitottuk és összekevertük pKN 184 plazmiddal (lásd 1. példa), amelyet előzőleg Pst I-el elhasítottunk, majd ligáltuk. A ligáit keveréket E. coli CSH 50 törzsbe transzformáltuk, 50 Mg/ml klóramfenikolt tartalmazó McConkey laktóz indikátor lemezen szelektálva klóramfenikol-rezisztenciára. A pJL 124-et befogadó sejteket, amelyek egy vagy több Pst I fragmenst hordoznak (lásd 2. példa) a Lac* fenotipus stabil öröklődésére vizsgáltuk X-gal lemezeken. A stabilan öröklődő plazmidok egyikéről úgy találtuk, hogy mind par A, mind par B területet tartalmaz. Ez a plazmid, a pOU2, 24 kb méretű és fenotípusa a kővetkező: CmR, Lac*, Par A*, Par B*. A plazmidot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképeztük (lásd 4. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy egy Pst I fragmens törölve van az EcoRl-A fragmensból. A plazmidot befogadó sejteket X-gal lemezeken 100 generáción át szelekciós kényszer nélkül növesztettük, és ilyen módon meghatároztuk, hogy a pOU2 stabilan öröklődik kevesebb, mint 10"*/sejt/generáció LF értékkel, ellentétben a pJL 124-el, amely 0,5- -1%/sejt/generáció gyakorisággal eltűnik a sejtekből. Az E. coli CSH 50/pOU2 törzset 2713. számmal helyeztük letétbe a DSM gyűjteményben. 3. ) pMBl replikon A pF 1403-11 (lásd 2. táblázat) a pBR 322-nek (amely egy pMBl-replikon) egy nem stabilan öröklődő származéka, amely egy F plazmidból származó gén és a lac operon közötti fúziót hordoz. A plazmid ApB, Lac* fenotipust kőzvetit. Az EcoRl-A : : Tn 5 fragmenst, amely a pOU 1-plazraidból (1. példa) származik, beiktattuk a pF1403-ll plazmid egyetlen EcoRl helyére közvetlenül a génfúzióval ellentétes irányban, ligáltuk és az E. coli CSH 50 törzsbe transzformáltuk, 50 Mg ampicillint tartalmazó lemezeken ApLre szelektálva, 50 Mg/ml kanamicint tartalmazó lemezeken KmB-re szelektálva és McConkey indikátor lemezeken Lac*-ra szelektálva. Az igy létrejött pOUlO plazmidot az 1. példa szerint leírt módszerrel restrikciós enzimekkel feltérképeztük (lásd 5. ábra), és az EcoRl-A : : Tn 5 fragmens beiktatását igazoltuk. A plazmid 34 kb méretű és fenotípusa a következő: Km8, ApH, Lac*, Par A*, Par B*. A plazmidot a 3. példa 1. részében leírt módszerrel stabil öröklődésre megvizsgáltuk. Ilyen módon demonstráltuk, hogy a pOU 10 stabilan öröklődik kevesebb, mint lO^/sejt/generáció LF-értékkel, míg a pF 1403-11 6 • 10-3/gene ráció gyakorisággal tűnik el a sejtből. Az E. coli CSH 50/pOU10 törzset 2714 számmal helyeztük letétbe a DSM gyűjteményben. 4. példa Az EcoRl-A fragmensból származó Pst I fragmens klónozása, amely stabilizálja a pJL 124- -et. Az EcoRl-A fragmenst egy sor restrikciós enzimmai hasítottuk, és az így nyert fizikai térképet az 1. ábrán mutatjuk be. Amint látható, a fragmens több Pst I fragmensból tevődik össze. Abból a célból, hogy csökkentsük a Par* fenotípust közvetítő fragmenB méretét, megkíséreltük szubklónozni a pJL124 átvizsgáló vektorban a par területeket, amelyeket valószínűleg egy vagy több Pst I fragmens hordoz (lásd 2. példa). Több korrekt fenotípusú - vagyis Lac-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
