201349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás D-aminosav-oxidáz előállítására
9 10 HU 201349 B Nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid-gél-elektroforézissel egy sávot kapunk (lásd az 1. ábrán), amelynek molekulatömege 43 000 körüli (lásd a 2. ábrán). A nativ fehérje molekulatömegét Hedrick és Smith módszerével 5 [Hedrick, J.L. és Smith, A. J.; Arch.Biochem. Biophys. 126, 155-164 (1968))) 86 000 körülinek találtuk. A D-aminosav-oxidáz ennek megfelelően aktiv formájában 86 000 körüli molekulatöme- 10 gű, két alegységgel biró dimerként létezik. A gélek D-leucinnal illetve cefalosporin C-vel való inkubálást követő festésekor a preparativ gélelektroforézissel nyert mintán csak egy sáv látható, míg a kevésbé tiszti- 15 tott, a 3. lépésből származó készítmény D-leucinnal való inkubálást követően 3, míg cefalosporin C-vel való inkubálást kővetően csak egy sávot ad. (Lásd a 3. ábrán.) Ez azt jelzi, hogy a Trigonopsisban néhány D-ami- 20 nosav-oxidáz vagy izoenzim van jelen, de ezek közül csak egy fejt ki aktivitást cefalosporin C-vel szemben. Trigonopsis variábilis D-aminosav-oxidáz tisztítására ismeretes egy eljárás, amelyet a Berg, C.P. és Rodden, F.A.; 25 Anal. Biochem. 71, 214-222 (1976) szakirodalmi helyen ismertetnek. A szerzők azonban a fehérjének csak a D-leucinnal szembeni aktivitását vizsgálták. Nem ellenőrizték az enzimkészítmény homogenitását. Az eljárás egy 30 szennyezett elegyet eredményez, amely elegy fehérjéi közül némelyek feltehetően aminosav-oxidázok. Az izolált, cefalosporin C-vel szemben aktív lényegében tiszta D-aminosav-oxidáz 35 tulajdonságai a következők: Az enzim izoelektromos pontja 4,6 körüli. Az atomabszorpciós elemzések erősen valószínűsítik, hogy az enzim két molekula vasat tartalmaz, ami alegységenként egy molekulának 40 felel meg. 10 mmól/l-es EDTA-val, illetve 1 mmól/l-es o-fenantrolinnal szemben végzett dialízis során az aktivitás változatlan marad. 0,5 mmól/l-es koncentrációnál az arzenites kezelés 46%-ra, a cianidos kezelés 34%-ra csökkenti az aktivitást. Cefalosporin C-re, fenil-alaninra, alaninra, metionra, illetve leucinra a Km értékek 13, 10, 76, 0,76, illetve 0,12. A preparativ gélelektroforézissel kapott minta 5 mg/ml koncentrációnál nem bir a flavin-dependens enzimekéhez hasonló spektrummal, amint az várható volt, mivel a cefalosporin C-vel szemben aktiv, sertésvese eredetű aminosav-oxidáz FAD-dependens [Mazzeo, P. és Romeo, A.; J.C.S. Perkin I(P3) 55 2532 (1972)]. Különböző flavin-kofaktorok, így FMN vagy FAD adagolása nem növeli a lecsökkent fajlagos aktivitást. Sikertelenek voltak a flavinok enzimből való kinyerésére irányuló kísérleteink. Így kálium-bromiddal szemben való extenzív dialízis mind savas közegben [Mayhew, S.G.; Biochim. Biophys. Acta 235, 289-302 (1971)], mind lúgos pH-n I Massey, V. és Curti, B.; J: Bioi. Chem. 241, 3417-3429 (1966)] sikertelennek bizonyult. Nem sikerült flavint nyerni tripszinezéssel, forralással vagy 85%-os fenololdattal való extrahálással sem. Ez az eredmény hasonló ahhoz, amelyet Aspergillus nigerből származó D-aminosav-oxidázzal kapcsolatosan ismertettek, ahol a szerzők nem voltak képesek flavin kimutatására [Kishore, G. és Vaidyanathan, C.S.; Indian J. Biochem. Biophys. 13, 216-222 (1976)]. A tiszta enzim pH 8,3-as, 20 mmól/l-es pirofoszfátpufferben fagyasztott állapotban stabil. A felolvasztás és a fagyasztás nem csökkentik az aktivitást. 8 °C hőmérsékleten az aktivitás igen lassan csökken, szobahőmérsékleten viszonylag alacsony a stabilitás. A hőstabilitás javítására az enzim különféle módszerekkel immobillá tehető. Például a 3. lépésben nyert 17,5 E/ml aktivitású enzimet 1 ml cianogén-bromiddal aktivált Sepharose 4B-vel pH 8,3-as, 0,1 mól/l-es borátpufferben 30 percig 30 °C hőmérsékleten reagáltatva tartós aktivitású 7 E/ml-es Sepharoset nyerünk. Berg és Rodden tápközegét helyettesítve [Berg, C.P. és Rodden, F.A.; Anal. Biochem. 71, 214-222 (1976)] a tenyésztési időt körülbelül ötödére csökkentettük. 0,2% DL-metionint adva a tápközeghez az enzimhozamot ötszörösére növeltük. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás cefalosporin C-vel szemben aktiv Trigonopsis variábilis D-aminosav-oxidáz lényegében tiszta formában való előállítására, azzal jellemezve, hogy i) a Trigonopsis variábilis nyers sejtextraktumot megsavanyítjuk és melegítjük, kívánt esetben a melegítés előtt enzimvédö anyagot adunk a sejtextraktumba, ii) a kapott csapadékot tartalmazó oldat felülúszóját, kívánt esetben dialízis és besűrítés után, annyi ammónium-szulfáttal kezel-45 jük, hogy második, a D-aminosav-oxidázt tartalmazó csapadékot kapunk, iii) a ii) lépésben kapott csapadékot újra felszuszpendáljuk és a D-aminosav-oxidázt kívánt esetben dialízist követően izoelektro-50 mos kicsapással kinyerjük, és kívánt esetben tovább tisztítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktumot ecetsavval savanyítjuk meg. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktumot 4 és 6 közötti pH-ra savanyítjuk. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktum pH-60 -ját 5,1-5,3-ra állítjuk be. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktum pH-ját 5,3-ra állítjuk. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal 65 jellemezve, hogy a megsavanyított nyers 7
