201349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás D-aminosav-oxidáz előállítására

12

HU 201349 B

sejtextraktumból melegítés előtt eltávolítjuk a jelenlévő csapadékot.

7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktumhoz melegítés előtt enzimvédö anyagként D,L-me- 5 tionint adunk.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal

jellemezve, hogy a D,L-metionint 25 mmól/1 végkoncentráció eléréséhez szükséges menynyiségben adagoljuk. 10

9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktumot 40- -60 °C-ra melegítjük.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktumot 40- 15 -50 °C-ra melegítjük.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktumot 50 °C-ra melegítjük.

12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, az- 20 zal jellemezve, hogy az i) lépésből származó felülúszót az ammónium-szulfátos kezelést megelőzően dializáljuk.

13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dialízist pH 8,3-as, 25 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfát oldattal szemben végezzük.

14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a felülúszót a dialízist követően, az ammónium-szulfáttal való keze- 30 lést megelőzően besűrítjük.

15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a besűrítést bepárlással végezzük.

16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, az- 35 zal jellemezve, hogy az ammónium-szulfátos kezelés során:

i) a felülúszóhoz 30 tömeg% koncentráció eléréséig ammónium-szulfátot adagolunk, majd

a kapott csapadékot eltávolítjuk; és 40

ii) az i) lépésben kapott felülúszóhoz az 55 tömegX koncentx-áció eléréséig ammónium-szulfátot adunk, majd a kapott csapadékot összegyűjtjük.

17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, az- 45 zal jellemezve, hogy a D-aminosav-oxidázt tartalmazó második csapadékot az izoelektromos kicsapással való elkülönítést megelőzően dializáljuk.

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, az- 50 zal jellemezve, hogy a dialízist pH 8,3-as,

20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfáttal szemben végezzük.

19. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az izoelektromos kicsa- 55 pást úgy végezzük, hogy

i) a második csapadékot pH 5,1-es,

25 mmól/l-es nátrium-acetát pufferrel szemben dializáljuk, a dialízálás után minden visszamaradó csapadékot eltávolítunk és 60

11

ii) a kapott oldatot pH 4,6-os,

100 mmól/l-es acetátpufferrel szemben dializáljuk, majd a kicsapódott tisztított D-aminosav-oxidázt összegyűjtjük.

20 Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az izoelektromos kicsapással kapott D-aminosav-oxidázt gélelektroforézissel tovább tisztítjuk.

21. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

i) a Trigonopsis variábilis sejteket szétroncsoljuk, és a kapott nyers extraktumot megsavanyítjuk;

ii) a megsavanyított nyers extraktumot 50 °C-ra melegítjük, a képződött csapadékot eltávolítjuk és a felülúszót dializáljuk, majd

iii) a ii) lépésben kapott oldatból a terméket ammónium-szulfáttal kicsapjuk és dializáljuk és

iv) a D-aminosav-oxidázt izoelektromos kicsapással elkülönítjük.

22. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

i) Trigonopsis variábilis nyers sejtextraktumot ecetsav adagolásával pH 5,3-ra savanyítunk, a képződött csapadékot eltávolítjuk, majd

ii) a felülúszóhoz 25 mmól/1 végtérfogat koncentráció eléréséig D,L-metionint adunk,

iii) a felülúszót 50 °C hőmérsékletre melegítjük és azt 10 percig 50 °C-on tartva a képződő második csapadékot elkülönítjük a felülúszótól,

iv) a iii)) lépésben kapott felülúszót pH 8,3-as 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfáttal szemben dializáljuk,

v) a iv) lépésben kapott oldathoz 30 tömeg% koncentrációig nátrium-ammónium-szulfátot adunk és a kapott csapadékot eltávolítjuk,

vi) az v) lépésben kapott oldathoz 55X végkoncenLrációig szilárd ammónium-szulfátot adunk, és a képződött csapadékot összegyűjtjük,

vii) a vi) lépésben kapott csapadékot először pH 8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfát-pufferrel szemben, majd pH 5,1-es, 25 mmól/l-es nátrium-acetát-pufferrel szemben dializáljuk, és a dialízis után visszamaradó minden szilárd anyagot eltávolítunk, majd

viii) a vii) lépésben kapott oldatot pH 4,6-os, 100 mmól/l-es acetátpufferrel szemben dializáljuk, és a képződő, D-aminosav-oxidáz-tartalmú csapadékot összegyűjtjük.

23. Eljárás D-aminosav-oxidázt tartalmazó immobilizált készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-23. igénypontok bármelyike szerint előállított D-aminosav-oxidázt cianogén-bromiddal aktivált Sepharose-val kapcsoljuk össze.

Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest - A kiadásért felel: dr. Szvoboda Gabriella osztályvezető R 4965 - KJK

90.3461.66-13-2 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Szabó Viktor vezérigazgató