201349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás D-aminosav-oxidáz előállítására
8 HU 201349 B 12 000 g-n 30 percig végzett centrifugálással eltávolítjuk. 2. lépés Hőkicsapás 730 ml az 1, lépésből származó savas felülúszóhoz az enzim védelmére 25 mmól/1 DL-metionint adunk. A felülúszót 50 °C hőmérsékletre melegítjük, és 10 percig vízfürdőben ezen a hőmérsékleten tartjuk. A kapott csapadékot 12 000 g-n 30 perc alatt lecentrifugáljuk és a csapadékot eldobjuk. A felülúszót pH 8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfát-pufferrel szemben éjszakán ót dializáljuk. 3. lépés Ammónium-szulfátos kicsapás A dialízishüvelyben lévő, a 2. lépésből származó mintát a fehérjetartalom növelésére (1%) meleg levegő átfóvásával besűrítjük. A minta pH-ját 2 mól/l-es ecetsavval pH 6,3-ra állítjuk be, majd a mintát 1-2 órán át szilárd ammónium-szulfáttal keverjük. A 30% ammónium-szulfáttal kisózott frakciót állni hagyjuk, hogy csapadék képződjön, majd 12 000 g-n 30 percig centrifugáljuk. A képződött csapadékot eldobjuk, a felülúszót a pH 6,0-ra való beállítása után szilárd ammónium-szulfáttal (55%) keverjük. A képződött csapadékot 30 percig 12 000g-n centrifugáljuk, majd pH 8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfáttal szemben dializáljuk. 4. lépés Izoelektromos kicsapás 10,3 ml, a 3. lépésből származó mintát 12 órán át pH 5,1-es, 25 mmól/l-es nátrium-ace-7 tát-pufferrel szemben dializálunk. A kapott csapadékot 12 000 g-n 30 percig végzett centrifugálással eltávolítjuk. A csapadék nyomokban tartalmaz enzimaktivitást. A felül- 5 úszót pH 4,6-os, 0,1 mól/l-es nátrium-acetát-pufferrel szemben 12 órán át dializálva ismét kicsapjuk. A képződött csapadék tartalmazza a D-aminosav-oxidáz-aktivitás nagy részét. A csapadékot pH 8,3-as, 20 mmól/l-es 10 pirofoszfátpufferben oldjuk és azonos pufferrel szemben egy éjszakán át dializáljuk. Preparatív diszk-gélelektroforézis 15 A 4. lépésből származó mintát preparatív gélelektroforézishez használjuk fel. Az elektroforézishez 5 mg a 4. lépésben kapott fehérjét alkalmazunk. A cefalosporin C-vel szemben aminosav-oxidáz-aktivitást mutató 20 sávot kivágjuk és Potter homogenizátorban, 1000 fordulat/perc mellett, pH 8,3-as, 20 mmól/l-es pirofoszfátpufferben 5 percig homogenizáljuk. A kapott szuszpenziót 1000 g-n 20 percig centrifugáljuk. A gélt 25 azonos térfogatú pufferrel háromszor mossuk, és az összegyűjtött felülúszókat meleg levegővel - az előzőekben ismertetettek szerint - 3 ml végtérfogatra sürítjük, majd a további vizsgálatokhoz felhasználjuk. 30 Eredmények és értékelésük A találmány szerinti eljárás egyszerű módszert biztosít D-aminosav-oxidáz homoge- 35 nitásig való tisztítására. Az izoelektromos kicsapást követő preparatív gélelektroforézissel eltávolítjuk a gélelektroforézisnél megfigyelt két további gyenge sávot. A fajlagos aktivitás 5,8 E/mg értékről 3,8 E/mg értékre 40 csökken. (Lásd az 1. táblázatban.) Ez feltehetően az extrahálás alatt bekövetkező részleges denaturálódás vagy még nem azonosított kofaktorok elvesztésének a következménye. 1. Táblázat Trigonopsis variábilis D-aminosav-oxidóz tisztítása. Az aktivitást cefalosporin C-vel szemben mérjük. A fehérjetartalmat Lowry és mts-i módszerével (lásd az előzőekben) határozzuk meg Kezelési lépések (Össz-Fehérje Fajlagos Tisztítás Hozam-aktivitás aktivitás (Egység) (mg/ml) (Egység/mg) (Hányszoros) (%) 1. Nyers extraktum 384 3,5 0,15 1 100 2. Hőkicsapás 3. Ammónium-szulfátos 308 5,6 1,0 6,5 80 (30-55%) kicsapás 300 6,0 4,9 33,0 78 4. Izoelektromos kicsapás (pH 4,6) 154 2,8 5,8 39 40 6
