201349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás D-aminosav-oxidáz előállítására
5 6 HU 201349 B amidgél lemezekhez mellékelt útmutatója szerint végeztük (LKB-Produkter AB, Hromma, Sweden, 1979). A vastartalmat a lundi egyetem analitikai kémiai tanszékén határozták meg atomabszorpciós spektrofotometriás eljárással. Tenyésztési körülmények: A vizsgálatokhoz alkalmazott mikroorganizmus, a Trigonopsis variábilis élesztő azonos a Brodelius és munkatársai által alkalmazott mikroorganizmussal (Brodelius, P., Nil— son, K. és Mosbach, K.; Appl. Biochem. Biotechnol. 6, 293-308 (1981). Nagyobb sejttömeget fermentorban, 8 literes tenyészetben nyerünk. Az alkalmazott tópközeg 1% élesztőkivonatot, 1,5% malátakivonatot, valamint 0,2% DL-metionint tartalmaz, pH-ja 6,0. A tenyésztést 44 órán ét 28 °C hőmérsékleten végezzük. A tőrzstenyészetet a fentivel azonos összetételű, de 2% agart is tartalmazó ferde agaron tartjuk fenn. A sejteket a tápközegböl 4000 g értéken 30 percen át folytatott centrifugálással gyűjtjük össze, majd az öszszegyűjtött sejteket mossuk és felhasználásig fagyasztva tároljuk. Több fermentáció átlagos sejthozama a 45-50 g sejtmassza tartományba esik. Elektroforézis: Analitikai célra diszk poliakrilamidgél elektroforézist végzünk Hedrick, J.L. és Smith, A.J. [Arc. Biochem. Biophys. 126 155—-164 (1968)] módszere szerint, valamint Laemmli, U.K. [Nature 227 680-685 (1970)] SDS- 35 -tartalmú gélekre alkalmazott módszere szerint. Az elektroforézist 8-10 °C hőmérsékleten végezzük. Kezdetben, a jelzőfestéknek a szeparálógélbe való vándorlásáig alacsony, csövenként 2 mA áramerősséget alkalmazunk, 40 ezt követően az áramerősséget állandó, 4 mA/cső értékre növeljük. A csövek átmérője 0,8 cm, hossza 9,5 cm. A fehérje helyzetének megállapítására a géleket az elektroforézis után Coomassie Brilliant Blue R színezé- 45 kekkel festjük. Az enzimaktivitásnak a gélen való helyzetét Hedrick és Smith előzőekben hivatkozott munkájában leírt módszerével vizsgáljuk, a géleket a képződött hidrogén-peroxid 50 kimutatásával - például o-dianizidin alkalmazásával - festjük. A géleket 5 mraól/1 cefalosporin C-t (vagy más aminosavat), 0,025% peroxidózt és 0,025% o-dianizidint tartalmazó pH 7,2-es 0,1 mól/l-es nátrium-foszfát-puf- 55 ferben inkubáljuk 30-60 percig, mialatt a vörösesbarna szinezék kialakul. Az enzim preparatív izolálására speciális berendezést dolgoztunk ki. Az üvegcső átmérője 2 cm, hossza 14 cm. 8%-os poliakrilamidgélt készítünk Hedrich és Smith szerint (lásd az előzőekben) pH 8,3-as, 0,19 mól/l-es trisz-glicin-puffer alkalmazásával. A felső gélt riboflavin helyett ammónium-perszulfát és TEMED jelenlétében polimerizáljuk, a katali- 65 zátorokat Laemmli eljárásában (lásd az előzőekben) megadott mennyiségben alkalmazzuk. Az elektroforézist 3-4 órán át 10 °C hőmérsékleten folytatjuk, az első 30 percben 5 20 mA, a továbbiakban 40 mA áramerősség alkalmazásával. A molekulatömeg meghatározása A molekulatömeget Hedrick és Smith eljárásával (lásd az előzőekben) határozzuk 10 meg, az SDS gélelektroforézist Laemmli eljárása szerint (lásd az előzőekben) hajtjuk végre. Az első eljárásnál SIGMA gyártmányú, nem-denaturált poliakrilamidgél elektroforézis molekulatömeg markereket (standardokat), a 15 másikhoz SDS molekulatömeg markereket használunk. A fehérjeineghatározást Lowry, 0. H., Rosebrough, N.J; Ferr, A.L. és Randall, R.J. [Bioi. C’hem. 193 265-275 (1951)] módszerével végezzük. 20 D-aminosav-ak ti vitás vizsgálata A D-aminosav-oxidázt 50 °C-on 5-10 percig vizsgáljuk az oxigénfogyasztás sebességének Rank oxigénelektróddal való meghatározásával. Ez idő alatt nem következik be 25 enzimdenaturálódás. A vizsgálati elegy 2 ml végtérfogatban 1,8 ml pH 8,0-as 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfátot, 0,1 ml 100 mmól/l-es cefalosporin C-t és annyi enzimet tartalmaz, amennyi a helyes kezdeti oxigénfogyasztási 30 sebességet biztosítja. 1 egység (E) az alkalmazott körülmények között 1 pmól oxigén/perc oxigénfelvételnek felel meg. Időről időre az aktivitást a képződött ketosav mennyiségének kolorimetriás módszerrel való mérésével is ellenőrizzük. A kolorimetriás vizsgálatot 30 °C-on 2,4-dinitro-fenil-hidrazin, valamint o-dianizidin-peroxidáz alkalmazásával végezzük (lásd az előzőekben). Példa Trigonopsis variábilis D-aminosav-oxidáz tisztítása: Minden műveletet 5 °C hőmérsékleten végzünk. 1. lépés Nyers extraktum készítése 32 g -20 °C hőmérsékleten fagyasztott sejtpépet felolvasztunk, majd 1,5 térfogat pH 8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfát-pufferben szuszpendáljuk. A sejtszuszpenziót azonos térfogatú porított szárazjéggel keverjük, majd mixerben roncsoljuk. A D-aminosav-oxidáz néhány más oldható fehérjével 60 együtt szabaddá válik. A szétroncsolt sejteket 30 percig 12 000 g-n centrifugáljuk. A szétroncsolt sejteket néhányszor új pufferrel mossuk és centrifugáljuk. Az összegyűjtött felülúszókat 2 mól/l-es ecetsavval pH 5,3-ra savanyítjuk, majd a kapott csapadékot 5
