201347. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és szintetikus táptalaj pseudomonas aeruginosa szelektív kimutatására
3 HU 201347 B 4 vegyes baktériumtörzs nem is oltható rájuk. Az összeállított táptalajok alkalmasak a piocianint nem termelő Pseudomonas aeruginosa törzsek egyszerű identifikálására. Az eljárás természetesen a piocianint termelő törzseknél is használható, de csak a már kitenyésztett Pseudomonas aeruginosa törzsek vizsgálatánál. A bejelentésünk tárgyát képező folyékony táptalaj az előzőekkel ellentétben egy lépésben képes a vizsgált mintákból szelektíven dúsítani és egyidejűleg biokémiai azonosítást is végezni. Az ismertetett biokémiai vizsgálatokhoz alkalmas táptalajok peptont is tartalmaznak, ezért nem tekinthetők a szintetikus táptalajokhoz hasonlónak. Ami a 37 °C és a 42 °C hőmérsékleten való inkubációt illeti, a szintetikus táptalajok nagy szelektivitásuk következtében 37 "°C-on is keltethetök, ezen a hőfokon ugyanis jobban nőnek a friss izolátumok. (Meg kell jegyezni, hogy az MSZ 3640/7-80. számú .Pseudomonas aeruginosa kimutatása és számának meghatározása* tárgyú szabvány a 41 "°C hőmérsékleten való inkubálást irja elő.) A Pseudomonas aeiuginosa tenyésztésének és kimutatásának módszereit az MSZ 3640/7-80. sz. szabvány ismerteti. Az ismert módszer szerint az adott esetben hígított vizsgálandó anyag 1 cm3-es mintáját nitrofurantoinos leves táptalajba - folyékony táptalajba, amely tripkazint (tripszinnel emésztett kazein peptont), gelizátot (zselatinfajtát), nátrium-kloridot, polietilón-glikol 300-at és nitrofurantoint tartalmaz - oltják, és a tenyészetet 48 órán át inkubálják. Ezután a zavarosodást mutató csövekből cetrimid agar táptalajra (szilárd táptalajra, amely peptont, magnézium-kloridot, kálium-foszfátot, centrimidet, agar-agart és glicerint tartalmaz) oltanak át, 24-48 órás inkubálási idő elteltével a típusosán fejlődő, pigmentált telepeket elkülönítik, és azokkal a következő biokémiai azonosító vizsgálatokat végzik el: karbamidbontás vizsgálata, indol-próba, nitrát-redukciós próba, mozgásvizsgálat és glükóz-fermentáció, piocianin kioldási próba, oxidázpróba. Amennyiben az elkülönített telepek valamennyi felsorolt vizsgálatban pozitív eredményt adnak, a mikroorganizmus Pseudomonas aeruginosaként azonosítható. Az ismert vizsgálat hosszantartó, időigényes 5-6 nap, ezért gyorsan romló élelmiszerek (például tej) minősítésére nem alkalmas. További hátrányt jelent, hogy az elkülönített telepeket hosszadalmas és bonyolult biokémiai vizsgálatokkal kell azonosítani, ami annak tulajdonítható, hogy az ismert összetételű táptalajok nem elég szelektívek, és azokon a kimutatandó Pseudomonas aeruginosa mellett még más mikroorganizmusok is képesek növekedni. Noha a folyékony táptalaj nitrofurantoint, a szilárd táptalaj pedig centrimidet tartalmaz az egyéb mikroorganizmusok fejlődésének gátlására, ezek gátló hatása a további mikroorganizmusokkal szemben nem elég intenzív. A nitrofurantoin és a centrimid emellett a Pseudomonas aeruginosa fejlődését is gátolja bizonyos mértékben, ami azt eredményezi, hogy a kimutatás nem elég érzékeny, és olyan minták is kórokozómentesnek minősülhetnek, amelyek tartalmaznak Pseudomonas aeruginosat. Látható, hogy az ismert vizsgálat a korábbiakban felsorolt követelményeknek nem tesz eleget. Kísérleteink során felismertük, hogy a Pseudomonas aeruginosa igen nagy szelektivitással tenyészthető olyan szintetikus (tehát fehérjekomponenseket vagy aminosavakat egyáltalán nem tartalmazó) táptalajokon, amelyek a baktérium számára hasznosítható szén- és nitrogénforrásként kizárólag acetamidot tartalmaznak. A Pseudomonas aeruginosa ugyanis azon igen ritka mikróbafajták közé tartozik, amelyek az acetamidot képesek bontani; igy a Pseudomonas aeruginosa a táptalajban önmaga képes előállítani a szaporodásához minimálisan szükséges ecetsavat és ammóniát. Tehát a szén- és nitrogénforrásként kizárólag acetamidot tartalmazó táptalajokon növekedni képes mikroorganizmus igen nagy valószínűséggel Pseudomonas aeruginosaként azonosítható. A Pseudomonas aeruginosa másik jellemző, és a mikróbafajták között igen ritka tulajdonsága az, hogy a nitrátokat nitrogénné képes redukálni, igy ha a szén- és nitrogénforrósként kizárólag acetamidot tartalmazó táptalajokon növekedni képes mikroorganizmus egyúttal a nitrátokat nitrogénné redukálja, akkor az biztonsággal Pseudomonas aeruginosaként azonosítható. A találmány tárgya tehát eljárás Pseudomonas aeruginosa szelektív kimutatására az azt tartalmazó vizsgálandó anyagokban oly módon, hogy a vizsgálandó anyag mintáját egyedüli szén- és nitrogénforrásként acetamidot, valamint adott esetben nitrátionokat és oxidálható kénvegyületet, és kivónt esetben magnézium-szulfátot és/vagy foszfátpuffert is tartalmazó táptalajon ismert körülmények között inkubáljuk, és a kifejlődött mikroorganizmust - kívánt esetben az ismert nitrát-redukciós próba elvégzése után - Pseudomonas aeruginosaként azonosítjuk. A találmány vonatkozik továbbá a fenti eljárás elvégzésére alkalmas táptalajokra is. A Pseudomonas aeruginosa tenyésztése folyékony és szilárd táptalajokon egyaránt elvégezhető. A folyékony táptalajnak 0,01-0,1 mól/dm3 acetamidot kell tartalmaznia vizes oldat formájában. A Pseudomonas aeruginosa a semmiféle egyéb adalékot nem tartalmazó vizes acetamid-oldatban is jól növekedik; kívánt esetben azonban - a növekedés serkentése céljából - magnézium-szulfátot és/vagy foszfátpuffert is adhatunk a táptalajhoz. A magnézium-szulfát maximális mennyisége 0,5 mól/dm3 lehet. Foszfátpufferként például 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
