201329. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a staurosporin metil-amino-csoportjának nitrogénatomján szubsztituált származékai és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
35 HU 201329 B 36 -függő protein-kináz-aktivitást a Reinmann és Beham által leirt [Meth.Enzymol., 99, 51-63 (1983)] módszerrel, 100 /ul-es reakcióelegyben határoztuk meg. Végső koncentrációban a következőket tartalmazta: 70 mM MES-NaOH, pH = 6,9, 75 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 2,5 mM Mg-acetát, 1,2 mg/ml szarvasmarha-szérum-albumin, 0,1 mg/ml kemptid, 0,01 E tisztított enzim és változó koncentrációjú vegyületek. A keveréket 32 °C-on 2 percre elő-inkubáltuk, és a reakciót 1 mM-os előmelegitett ATP (0,5 mCi gamma-[32P]-ATP) hozzáadásával indítottuk meg. 50 pl-es alikvot részleteket elemeztünk foszforilálási szubsztrátumra, P81 kromatografálási papirt alkalmazva gyűjtő anyagként. Az epidermisz-növekedési faktor (EGF) receptor tirozin-specifikus foszforilációjának vizsgálata: Az EGF receptort A431 sejtekből különítettük el és az enzimes aktivitást House és munkatársai által leirt [Europ.J.Biochem., 140, 363-367 (1984)] módszerrel határoztuk meg, kisebb módosítással, angiotenzin Il-t alkalmazva szubsztrátumként. A reakciókeverék (50 pl) 5 pl A431 membránkészítményt (kb. 50 /ug protein), 10 nM HEPES-t, pH = 7,4, 10 mM MgClí-t, 1 mM Na3-ortovanadátot, 0,1% Triton X-100-at, 13,5 juM gamma-[32P]-ATP-t, 1 mM epidermisz növekedési faktort, 50 pg angiotenzin Il-t és változó koncentrációjú vegyületeket tartalmazott. A membránokat EGF jelenlétében vagy távollétében 10 percre elóinkubáltuk jégen. A reakciót gamma-l32?]-ATP hozzáadásával inditottuk meg és az inkubálást 37 °C-on 5 percig folytattuk. A reakciót 100 pl 10%-os triklórecetsav hozzáadásával állítottuk le, majd a reakcióelegyet 30 5 percre jégre tettük. 1.500 g-n 5 percig végzett centrifugálás után a felülúszó alikvot részét P81 jelzésű kromatografáló papírra cseppentettük és a szűrőpapírt 6%-os ecetsavoldatban 5-ször mostuk. A szűrőpapírokat 10 megszárítottuk és a radioaktivitást folyékony szcintillátoros számlálókészülékben mértük. 3. Eredmények 15 Az adatokat az I. táblázatban foglaltuk össze. A staurosporin, valamint a találmány szerinti vegyületek a protein-kináz C koncentráció-függő gátlását idézik elő. Az IC50- 20 -értéket lineáris regessziós analízissel határoztuk meg, 6, ill. 32 nM és 570 nM között. A találmány szerinti vegyületek, ellentétben a staurosporinnal, nagyfokú szelektivitást mutattak az EGF receptor cAMP-függó 25 protein-kináz, illetve tirozin-kináz aktivitásának vizsgálata során. Amint azt az I. táblázatban összefoglaltuk, a találmány szerinti vegyületekkel nyert IC50 értékek a cAMP-függő protein-kináz aktivitásra (f = 30 = PKA:PKC) 12-, illetve 800-szorosnál nagyobb érték között változnak, EGF-receptor tirozin-kináz aktivitásra (f = TPK:PKC) pedig 10- és 800-szorosnál nagyobb értékek között. 35 I. TÁBLÁZAT A protein-kináz aktivitásokra in vitro észlelt hatások Vegyület in vitro enzim-gátlás, IC50, pM Példa PKC PKA [f=PKA:PKC] TPK [f=TPK:PKC] sorszáma 18. 0,050 2,4 48 3,0 60 24. 0,150 6,6 44 20 133 23. 0,041 1.6 39 6,5 159 13. 0,075 1,5 20 5,0 67 14. 0,032 2,3 72 0,85 27 26. 0,057 6,8 12 6,0 10 36. 0,035 28 80 46 131 28. 0,063 2,5 40 1,4 22 38. 0,125 >100 >800 >100 >800 Staurosporin 0,006 0,15 3 0,025 48 PKC: Protein-kináz C PKA: cAMP-függő protein-kináz TPK: Az epidermisz-növekedési faktor receptor tirozin-specifikus protein kináza f: a PKC-gátlás irányában mutatott szelektivitást tükröző faktor; IC50 (mM) a szelektivitás-vizsgálatra: IC50 PKC (pM). 20
