201156. lajstromszámú szabadalom • Reagens és eljárás alakos test standard készítéséhez
1 HU 201156 B 2 A találmány tárgya alakos test standardok készítéséhez alkalmas reagens és eljárás a standardok előállítására. A találmány szerint előállított standardok trombociták, fehérvérsejtek és vörösvértestek meghatározásánál alkalmazható, akár kézi, akár gépi vizsgálatok kalibrálásánál. Felhasználásukkal lehetővé válik a normál, kórosan alacsony, illetve magas sejtszámok, átlagtérfogat eltolódások, valamint az alakos testek térfogateloszlásának ellenőrzése. Az alakos testek a vér fontos alakos elemei, amelyek mennyisége és térfogata a betegség megállapítása szempontjából fontos. Az alakos testek mennyiségi és térfogati mérése akkor lehetséges biztonságosan, ha a méréseket megfelelő standardokkal ellenőrizni tudjuk. Ez főként olyan berendezések esetén lényeges, amelyek nem részecskéket, hanem impulzusokat számlálnak, és a vezetőképesség-változás nem egyértelműen tükrözi a részecskék számát és térfogatát. A standardokkal szemben támasztott követelmény, hogy követett paramétereik időben ne változzanak és külső körülmények se befolyásolják ezeket. A vérdiagnosztikai standardoknál a standard stabilitása annál is inkább fontos, mert egy beteg állapotának megítélésén kívül a kezelés hatékonyságának követésénél aránylag kis változásokat is észlelni kell. így a standard a meghatározás ellenőrzésénél igen fontos szerephez jut. Standard gyanánt főleg vérkészítményeket alkalmaznak. Léteznek ugyan szintetikus standardok, ezek főként polimer részecskék, ezek azonban nem képesek teljes mértékben (például sűrűség vagy formafaktor) alakos testeket utánozni. A vérből kivont alakos testekből azonban csak akkor állíthatunk elő standardot, ha kiküszöböljük az időbeni, illetve méretváltozást és az agglutináció (sejtfal összetapadás) lehetőségét. Vérből nyert standardok készítésével foglalkozik például a 4 405 719, 4 287 087, illetve a 4 302 355 számú USA-beli szabadalmi leírás. A leírt készítmények hátránya, hogy nem közvetlenül használhatók fel, vagy tárolás során paramétereik változnak, és így nem megbízhatóak. Például szárított standardból csak külön műveleti lépéssel állíthatunk elő használható standardot, vagy egy másik esetben a standard sejttérfogata csak alig pár hónapig stabil, más esetekben pedig a sejtstabilizáló reagens minősége tér el a mérések alkalmával használt hígítók minőségétől, ami szintén a sejt térfogatváltozásához vezet. A 4 160 644 számú USA-beli szabadalmi leírás vérlemezke referencia előállítását ismerteti, amelynek során az aldehiddel fixált vagy izotóniás oldószerben felvett vérlemezke szuszpenzióhoz stabilizálószerként 0,1-200 g/1 polietilénglikolt ad, majd a szuszpenziót izotóniás oldószerrel hígítja vagy aldehiddel fixálja. Keményítőanyagként például glutáraldehidet alkalmaz. Az eljárás hátránya, hogy megfelelő stabilitás eléréshez igen nagymennyiségű polimer szükséges, a referenciaanyag felhasználhatósága nem minden esetben teljesen kielégítő. Találmányunk kidolgozása során célunk olyan reagens előállítása volt, amely felhasználásával hígítás után is (szám és sejttérfogat szerint egyaránt) stabil standard állítható elő. A találmány szerinti reagens nátrium-klorid és kálium-klorid 30:1 tömegarányú keverékéből álló 0,8-1,0 vegyes%-os sóoldat egy literében oldva- 1-15 mól barbitursav, barbiturát vagy 5,5.-dietil-barbiturát puffert,- ÍO^-IO"4 mmól etilén-diamin-tetraecetsav nátrium- vagy káliumsóját,- 0,2 mikrontól - 44 millimól N-klór-4-metil-benzol-szulfonamid nátriumsót és/vagy N-klóramid-4- -benzol-szulfonamid nátriumsót,- 0,1-10 millimól lítium-hidroxidot és/vagy lítium-kloridot,- 0,1-5 millimól nátrium-hidroxidot,- KH-IO-4 mól glutáraldehid, vagy krotonaldehid sejtfal keményítő anyagot és- KH-IO"4 vegyes%, 105—107 móltömegű, vízoldható lineáris védőpolimert, előnyösen polivinil-pirrolidont, polivinil-alkoholt vagy poliakrilamidot tartalmaz. A találmány szerinti reagensben a barbitursav, barbiturát vagy 5,5.-dietil-barbitursav-alapú puffer kíméli a vér-proteinek peptidkötéseit, meghatározza a pufferkapacitást és egyúttal hozzájárul a fertőtlenítő hatás növeléséhez. Az N-klór-4-metil-benzol-szulfonamid-nátriumsó (ismert nevén Kloramin T) vagy N-kloramid-4-benzol-szulfonamid-nátriumsó (ismert nevén Kloramin B) fertőtlenítő hatással rendelkezik, de a barbiturát puffer jelenléte fertőtlenítő hatását nagymértékben fokozza. A 10~2-1(H nmól/1 koncentrációban jelenlévő nátrium- vagy kálium-etilén-diamin-tetraacetát ismert módon komplexáló és az agglutinációt gátló hatást fejt ki. A lítium-hidroxid vagy lítium-klorid jelenléte a sejtek térfogatának stabilitását biztosítja, de a lítium-hidroxid egyúttal a pufferhatás kialakításában is döntő szerepet játszik. A nátrium-hidroxid a pH végső beállítására szolgál. A sejtfalkeményítő anyag előnyösen glutáraldehid vagy krotonaldehid lehet. Szerepe a sejtfal szilárdságának növelése egy polimerizációs folyamat révén. A védőpolimer előnyösen egy egyenes szénláncú, vízoldható polimer, például polivinil-pirrolidin, -alkohol, nátrium-poliakrilát vagy poliakrilamid lehet. A polimerek móltömege 10®—107 között változhat, előnyösen 2xl06. A védőpolimer egy hidrofil védőburkot hoz létre a védendő sejt körül, ami ezáltal hosszútávú létezést biztosít minden egyedi sejtnek. A találmány szerinti reagenssel standardot úgy állítunk elő, hogy reagens 10-5000 cm3-ét max. 0,2 p pórusátmérőjű szűrőn szűrjük, 1 liter vérből nyert trombocita, fehérvérsejt vagy vörös vértest masszához adjuk keverés közben, majd az elegyet 5-20 g között centrifugáljuk, a kapott üledéket 5-20 g között és a kapott felülúszót 50-150 g között újracentrifugáljuk és kívánt esetben az újracentrifugálást az előző lépésből kapott üledékkel és/vagy felülúszóval egy vagy több alkalommal megismételjük teljes tisztulásig, kívánt esetben a különböző frakciókból a trombocitákat, fehérvérsejtekét, illetve vörösvértesteket elválasztjuk. Eljárhatunk úgy is, hogy keményítőanyag nélküli reagenssel végezzük a szétválasztást és azt a kész standardhoz adjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
