201156. lajstromszámú szabadalom • Reagens és eljárás alakos test standard készítéséhez
1 HU 201156 B 2 Ennek során a keményítőanyagot nem tartalmazó találmány szerinti reagenst szűrés után a kezeletlen vérrel elegyítjük, az elegyet a fentivel azonos módon szétválasztjuk, majd a keményítőanyagot a kapott standardhoz hozzáadjuk. A kezelt részecskéket kívánt esetben ismételt mosással és ülepítéssel tisztítjuk. Az ismételt mosásnál a mosószer azonos a tartósításra használt reagenssel. Az ülepítéses eljárás során az alakos testeket térfogat szerint frakcionálhatjuk. Ugyanis ha az alakos test szuszpenziót 5-20 g gyorsulásnak megfelelő fordulatszámmal centrifugáljuk, akkor a vörös vértestek és a fehérvérsejtek, illetve a trombociták nagy része, főként a nagy térfogatúak, leülepszenek, az alakos testek egy része azonban a felülúszóban marad. Ha a folyadékot 50-150 g-nek megfelelő gyorsulással centrifugáljuk, minden alakos test teljesen kiválik, így a szétválasztás során kis, normál, illetve nagy térfogatú alakos testek szuszpenziója kívánság szerint előállítható. A találmány szerinti standardok egyszerű módszerekkel, egyszerű reagens segítségével előállíthatok, tárolás és felhasználás során stabilak, paramétereik (alakos testek száma és térfogata) nem változnak. A találmány szerinti reagens összetételét az alábbi példákkal szemléltetjük anélkül, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk. 1. példa 2.3 g barbitursavat, 0,03 g kloramin T-t, 3,0 g etilén-diamin-tetraecetsav-dinátriumsó-hidrátot, 10,4 g nátrium-kloridot, 0,072 g lítium-hidroxidot, 0,3 g kálium-kloridot, 0,03 g nátrium-hidroxidot 800 ml ioncserélt vízben oldunk fel. A teljes oldódást követően 0,004 g l,6xl06 móltömegű poliakril-amidot, majd 2,0 g tiszta tömegű polimert és glutáraldehid nélkül előállított reagenssel hígított 1 % koncentrációjú glutáraldehidet adunk hozzá. Az oldatot 1000 ml-re töltjük fel ioncserélt vízzel, majd 0,2 pm pórusátmérőjű szűrőn szűrjük. A kész oldat azonnal vagy hosszabb tárolást követően is alkalmas standard készítésére. 2. példa Rl reagens: 2.3 g 5,5.-dietil-barbitursav 0,03 g N-klór-4-metil-benzol-szulfonamid-nátriumsó 0,03 g nátrium-hidroxid 3.0 g dinátrium-etilén-diamin-tetraacetát-dihidrát 0,072 g lítium-hidroxid 0,3 g kálium-klorid 10,4 g nátrium-klorid 1000 ml ioncserélt vizes oldatban R2 reagens: Az Rí reagens első hét komponense, amelyhez hozzáadunk 0,04 g l,6xl06 móltömegű poliakrilamidot és 2.0 g glutáraldehidet 1000 ml ioncserélt vizes oldatban. A vért 1:1 arányban keverjük R|-gyel, homogenizáljuk, majd 10 g alatt 30 percen keresztül centrifugáljuk. az üledéket leválasztjuk. Ez tartalmazza a vörös vértesteket, a fehérvérsejtek egy részét és kisebb mértékben trombocitát. A felülúszó tartalmazza a trombociták nagy hányadát és a fehérvérsejtek (FVS) és a vörös vértestek (VVS) egy részét. Az üledéket ismét felhígítjuk Rt-gyei, a műveletet így ismételjük tisztulásig. Eközben a VVS teljesen szétválik a FVS-től és a trombocitákból. A megtisztított VVS-t 1:5 térfogatarányban R2-ben szuszpendáljuk, 2-24 órát állni hagyjuk, ülepítjük, hemolízis-vizsgálatnak vetjük alá, és ha szükséges, a műveletet megismételjük. Az így nyert massza, a VVS standard alapanyag, amelyből előállítjuk a igényelt frakciókat, majd beállítjuk a szükséges töménységet. A felülúszókat hemoglobintartalom, FVS mennyiség és trombocitaszám szerint osztályozzuk, és ennek alapján döntünk a frakció további sorsáról. Ha a VVS túlsúlyban van, 10 g alatt 15 percen keresztül centrifugáljuk, ha a FVS van túlsúlyban, 12 g mellett 10 perc a centrifugálási idő, ha pedig a trombocita van túlysúlyban, akkor 20 g körül centrifugáljuk 20 percen keresztül. A kapott üledékek további szétválasztásra szorulnak a teljes tisztulásig. Ha a szedimentum 20 g mellett teljesen színtelen, a felülúszó gyakorlatilag tiszta trombocitát tartalmaz. Ezt 100 g mellett 30 perc alatt teljesen le tudjuk ülepíteni. A masszát ismételten ülepítjük és R2-ben szuszpendáljuk. Ebből a masszából készül a magas és a normál trombocitaszámú standard, frakcionálás révén. A 20 g alatt tisztított trombociták szolgáltatják az alacsony trombocitaszámú standardot. A FVS folyamatos dúsítás eredménye, és a két extra leválasztás során válik standard alapanyaggá. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Alakos test standardok készítésére alkalmas reagens, amely agglutináció gátló szerként etilén-diamin-tetraecetsav nátrium- vagy -káliumsóját, valamint keményítőanyagot, védőpolimert és puffert tartalmaz, azzal jellemezve, hogy nátrium-klorid és kálium-klorid 30:1 tömegarányú keverékéből álló 0,8-1,0 vegyes%-os sóoldat 1 literében oldva- 1-15 mól barbitursav, barbiturát vagy 5,5.-dietil-barbiturát puffert,- lO^-lO“4 mmól etilén-diamin-tetraecetsav nátrium- vagy káliumsóját,- 0,2 mikrontól - 44 millimól N-klór-4-metil-benzol-szulfonamid nátriumsót és/vagy N-klóramid-4- benzol-szulfonamid nátriumsót,- 0,1-10 millimól lítium-hidroxidot és/vagy lítium-kloridot,- 0,1-5 millimól nátrium-hidroxidot,- 10~I-1(H mól glutáraldehid vagy krotonaldehid sejtfal keményítő anyagot és- 10~2-1(H vegyes%, 105— 107 móltömegű, vízoldható lineáris védőpolimert, előnyösen polivinil-pirrolidont, polivinil-alkoholt vagy poliakrilamidot tartalmaz. (Elsőbbsége: 1987. 05. 26.) 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy sejtfal keményítő anyagként 10~3 mól krotonaldehidet tartalmaz. (Elsőbbsége: 1987. 05. 26.) 3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy védőpolimerként 10-3 vegyes% l.őxlO6 móltömegű poliakrilamidot tartalmaz. (Elsőbbsége: 1987. 05. 26.) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
