201119. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kedarcidin és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
13 HU 201119 B 14-gly-tyr-val-met-pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val--asp-cys-asp-thrala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thrgly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH. C-terminális Két minor komponenst azonosítottunk még; az egyiknél hiányzik a főkomponens első alaninja, a másiknál a főkomponens első két aminosavja, azaz alanin és szerin. A molekulatömeg meghatározás történhet gélszűréses/HPLC módszerrel és nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid géles elektroforézissel (SD-PAGE). a) Gélszűrés/HPLC módszer: TSK-G 200C SW (7,5 x 300 mm) oszlopot (LKB Producter AB, Svédország) használunk a gélszűréshez; az eluens 0,5 M nátrium-kloridot tartalmazó 50 mM trisz-HCl puffer (pH = 7,4); átfolyási sebesség 0,5 ml/perc. Ugyancsak használhatunk Waters oszlopot (Waters Associates Protein Analysis Column 1-125); az eluens ez esetben 0,2 M trisz-acetát és az átfolyási sebesség 1 ml/perc. Az összehasonlítási görbe alapján meghatározott molekulasúly: 17000 Dalton. Az összehasonlítási görbét standard molekulasúlyú markerekkel (Bio Rád Laboratories) készítjük el. b) SDS-PAGE módszer: a proteinmintát és az ismert molekulasúlyú referens anyagokat (Diversified Biotech, Maine) azonos térfogatú Seprasolal (használatra kész proteinoldó közeg, mely szacharózt és nyomjelző festéket tartalmaz) keverjük össze és közvetlenül az elektroforézis előtt 3 percen át melegítjük 90 °C hőmérsékleten. Az elektroforézist 300 V feszültségnél végezzük Seprabuffban (trisz-glicin-SDS, pH = 8,3), amíg a festék el nem éri a gél alját. Ezután a gélt festóoldatba (1,25 g Comassie BB R-250, 92 ml jégecet 908 ml vizes metanolban) merítjük legalább 10 órán át, majd mosó oldatban (75 ml jégecet és 50 ml metanol 875 ml vízben) áztatjuk, amíg a gól háttere áttetszővé nem válik. A Seprasol és a Seprabuff az Integrated Separation System-től származik (Massachusett). Az így meghatározott molekulatömeg 12400 Daltonnak adódott. Izoelektromos fókuszálás: A fókuszáláshoz használt gélt az alábbi összetételű keverékből készítjük el: 29,IX akrilamid vizes oldat 0,9X N,N-meti!én-bisz-akril-10 ml amid vizes oldat 10 ml glicerin 7 ml 1802 Ampholine, pH = 2,5-4 3 ml vízzel feltöltve 60 ml-Az oldatot 10 percen át gáztalanitjuk, majd hozzáadunk 1,5 ml lX-os ammónium-perszulfát vizes oldatot és 10 pl N,N,N',N’-tetraraetil-etilén-diamint. A keveréket kiöntjük az öntőformába és hagyjuk polimerizálódni. Az elektródoldat az anódnál 1 M foszforsav, a katódnál 2X-os 1809 Ampholine, pH = 6,8. A fókuszálást 25 W állandó teljesítményű elektromos árammal végezzük 2 órán át. A megadott százalékok vegyesszézalékot jelentenek. A megállapított izoelektromos pont: 3,65 és a kálódtól mért megtett út 6,25 cm. Biológiai aktivitás: a protein tumorellenes hatásét transzplantálható egér vagy patkány P388 leukémiával szemben vizsgáljuk. DBA/2 donor egérből intraperitoneálisan (ip) vagy intravénásán (iv) 106 P388 leukémia sejtet juttatunk be CDFi egérbe. Az intraperitoneálisan bevitt P388 leukémia sejtekkel kezelt állatok a bevitelt követő naptól számított 5 napon át naponta egyszer intraperitoneálisan fiziológiás sóoldatot (kontroll állatok) vagy kedarcidin dózist kapnak. Az intravénásán bevitt P388 leukémia sejtekkel kezelt állatok a kedarcidint ugyancsak intravénásán a beviteltől számított első (azaz Következő), harmadik és ötödik napon kapják. Az állatokat naponta megvizsgáljuk és elpusztulásuk idejét feljegyezzük. Mindegyik csoportnál meghatározzuk az átlagos testtömeg-változást (a leukémia sejtek bevitelének napjától az utolsó kezelés napjáig), ezzel jellemezve a hatóanyag toxicitásál. Ennek további jellemzésére megadjuk az 5. napon életben lévő állatok számát is. Értelemszerűen nem tekintjük terápiás eredménynek, ha a kezelt csoportok állatai közül az 5. napig egynél több állat pusztul el. A kezelt csoportok 4 vagy 6, a kontrollcsoportok 10 darab egérből állnak. Ugyancsak feljegyeztük, hogy hány állat éli túl a 30. napot, a kísérlet utolsó napját. A vizsgálat végén minden csoportnál meghatározzuk a túlélési idő középértékét és meghatározzuk a T/CX-ot, amit úgy számolunk ki, hogy a kezelt csoport túlélési idejének középértékét elosztjuk a kontrollcsoport túlélési idejének középértékével, éB a kapott értéket megszorozzuk százzal. Akkor beszélünk szignifikáns tumorellenes hatásról, ha a T/CX értéke 125 vagy ennél nagyobb. Az in vivo adatokat az V. és VI. táblázatban foglaltuk össze. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
