201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
17 HU 201116 B 18 irányban lehetséges beiktatni egy olyan strukturgént, amelynek kifejeződése ezzel a promotorral szabályozható. Példaként: egy lac promoter nélküli lac gént (amely lac operonként ismeretes) beiktatunk a cl génnel azonos irányban, és a nyert gén termék menynyiségnövekedés azt sugallja, hogy a lac gének átírását, legalábbis részben, a cl promoter szabályozza (lásd 8. példa). így az volt demonstrálható, hogy a találmány szerinti plazmidokat lehet klónozó vektorként használni egy idegen gén beiktatásánál. A cl promotornak az az előnye, hogy a cl represszorral is szabályozható, így a gén-termék mennyiségi növekedése párhuzamosan megy végbe a pl&zmid DNS mennyiség-növekedésével. A második promoter szintén lehet a promotor, mint pl. aPl, vagy lehet rec A promoter. Amikor a második promoter aPl, ezt be lehet iktatni egy plazmidba pl. A fágból származó Bara HI- Bgl II fragmensbe, így egy kellemes klónozó helyet alakítva ki (Bam Hl) számos restrikciós enzimmel, pl. Bam H 1- -gyel, Bgl Il-vel, Sau 3 A-val és Bel I-gyel kialakított DNS fragmensek beiktatásához. A APL-et szintén be lehet iktatni egy promotort hordozó plazmidból eredő megfelelő DNS fragmensbe. aPl előnyös második promotorként, mivel ez is szabályozható hőérzékeny cl represszorral úgy, hogy a mennyiség-növelési feltételek azonosak. Másrészt ha a promoter rec A, azt be lehet iktatni a találmány szerinti plazmidba mint pl. pBEU14-böl (Uhlin és Clark: J. Bact. 148, 1981, 386-90) származó Bam Hl fragmenst. Ez a promoter különböző módokon funkcionál, a mikrobiológiai törzstől függően, amelybe a rec A promotor-hordozó plazmidot transzformáljuk. Egy rec A törzsben a rec A-t a lex A represszor szabályozza, amely a mikroorganizmus kromoszómáján helyezkedik el. Egy szabályozatlan replikáció hőmérséklet-indukciójánál pl. a plazmid kópiaszáma és ezáltal a rec A promotorok száma fokozatosan növekszik. Mivel a lex A represszor csak kis mennyiségben termelődik, és szorosan a rec A promoter területhez kapcsolódva funkcionál, a lex A represszor rendelkezésre álló mennyiségét fokozatosan kell titrálni, amikor a kópiaszám növekszik. így a rec A fokozatos derepressziója lép fel, és amikor a plazmid kópiaszáma nagyobbá válik, a rec A-ból történő átírás ennek megfelelően növekszik. A találmány szerinti plazmidok, mint klónozó és termelő vektorok. A klónozó és termelő vektor-képességükben a találmány szerinti plazmidok számos jellemző tulajdonsággal bírnak: 1. ) A plazmidok kis molekulatómegüek (4,0-12,5.10£ dalton). A kis méret megkönnyíti a kezelést és javítja a transzformáció hatásosságát. 2. ) A plazmidok több egyedi hellyel rendelkeznek restrikciós endonukleázokhoz. Az .egyedi' kifejezést úgy kell érteni, hogy egy fajlagos restrikciós endonukleázhoz a plazmid egy és csak egy, az enzimmel hasítható hellyel rendelkezik. 3. ) Amint korábban említettük, a replikációs területen belül elhelyezett restrikciós területek nem engedhetők meg, mint klónozó helyek. így a következő példákban leirt plazmidok ban a Sal I és Pst 1 restrikciós helyek nem felelnek meg klónozó helyekként, mivel ezek a plazmid replikonjában helyezkednek el, mig az EcoRI és BamHI restrikciós helyek nem ezen a kritikus területen belül helyezkednek el és igy hasznos helyeket képeznek az idegen DNS bevezetéséhez. Ha nem található megfelelő restrikciós hely magában a plazmidban, azt egy kis, ilyen helyet tartalmazó DNS fragmens (amely .összekötő'-ként, vagy .linker'-ként ismeretes) plazmidba történő beiktatásával ki lehet alakítani, ahogy ezt a 4. példában leírjuk. Abból a célból, hogy a beiktatott strukturgén kifejeződését biztosítsuk, szükséges egy megfelelő átírási indító (start) jellel (riboszomális kötőhely) rendelkezni, amely magával a strukturgénnel ellenkező irányban, de a második promotorral azonos irányban helyezkedik el. A riboszomális kötőhely jelenléte biztosításának egyik útja DNS-fragmensek választékának (pl. kötőhelyenként történő) beiktatása, amely DNS fragmenseket el lehet készíteni szintetikusan, és amelyek mind hordoznak egy eltérő strukturgénhez tartozó átírási start-jelet. Egy más módszer szerint egy olyan gént hordozó DNS fragmenst, amely génről mór ismeretes, hogy mikroorganizmusokban kifejeződik, beiktathatunk a .megvaduló' klórozó vektorba, teljes egészében, így biztosítva a korrekt átírási start-jel jelenlétét. 4. ) Bár, amint fentebb említettük, előnyös, ha a klónozó vektor olyan kicsi, amilyen csak lehet, gyakorlati célokra az a célszerű, ha a klónozó vektor egy olyan gént is hordoz, amely a plazmidot hordozó sejtek azonosításához és/vagy szelekciójához használható úgynevezett .marker' kifejeződésére szolgál. A leghasználhatóbb marker az antibiotikum-rezisztencia, pl. az ampicillin-rezisztencia, mivel ez lehetővé teszi, egy rekombináns plazmidnak a mikrobiális gazdasejtbe transzformálásához szükséges kezelés után, azoknak a mikroorganizmusoknak a könnyű kontraszelekcióját, amelyek nem fogadták be a rekombináns plazmidot. Egy másik marker, amely a következő példákban leírt plazmidok mindegyikében jelen van, a A immunitás, amelyet a cl gén kódol. A találmány szerinti plazmidokban egy további hasznos tulajdonság lehet egy olyan gén jelenléte, amely egy olyan szelektálható fenotipust közvetít, amelyen belül egy egyedi restrikciós hely helyezkedik el. Egy DNS fragmens beiktatása ennél a helynél a gén beiktatási inaktiválását eredményezi. Erre 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
