201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
19 HU 201116 B 20 írunk le példát a 9. példában, egy olyan génre vonatkozót, amely Lac* fenotípust közvetít, és a 12. példában egy olyan génre vonatkozót, amely klóramfenikol rezisztenciát kódol. Ha kívánatos egy marker, pl. antibiotikum-rezisztencia bevitele egy olyan találmány szerinti plazmidba, amelyet klónozó vektorként kívánunk használni, ezt egy idegen DNS fragmens áthelyezésével (transzponálásával) vagy beiktatásával lehet végrehajtani ismert módon. Ilyen transzponálásra a 4. példában található példa. A tenyésztés módszerei A jelent találmány tárgya továbbá eljárás a plazmid DNS géntermékeinek előállítására, amely magában foglalja 1.) egy plazmidot hordozó mikroorganizmus tenyésztését - amely plazmidba egy szabályozható promotor van beiktatva olyan módon, hogy az átírás szabályozza a replikációt, előnyösen olyan módon, hogy ebből a promotorból eredő megnövekedett átírás egy jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid kópiaszámhoz vezet -, a módszer a tenyésztésnek legalább egy olyan periódusát tartalmazza, amely olyan körülmények között megy végbe, amely biztosítja a megnövekedett átírást a szabályozható promotorból jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan kópiaszámot eredményezve, és 2.) a mikrobiológiai tenyészetből a plazmid egy gén-termékének kinyerését. A tenyésztés önmagában megfelelően kivitelezhető hagyományos technikákat alkalmazva, beleértve a hagyományos tápközegeket is, amelyek optimálisak a szóban forgó faj esetén. A gén-termék kinyerését hasonlóképpen végre lehet hajtani a jól ismert módszerekkel, amelyeket hozzá lehet illeszteni a szóban forgó elkészített gén-termék tulajdonságaihoz, a gazda-mikroorganizmus tulajdonságaihoz, stb. A jelen találmány továbbá olyan módszerre vonatkozik, amely szerint a gazda-mikroorganizmust, amelybe a találmány szerinti plazmidot transzformáltuk, olyan körülmények között növesztjük, amely állandó, kis kópiaszámot eredményez az inokulálási és sokszorozódási szakaszban, amig a kívánt sejtszámot el nem érjük, majd a gazda-mikroorganizmust olyan körülmények között tenyésztjük, amely egy jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan kópiaszámhoz vezet. így a tenyésztést először olyan körülmények között végezzük, ahol a promotorból eredő bármiféle átírás jelentősen nem befolyásolja a plazmid kópiaszámát, ez után egy olyan anyagot adunk a tápközegbe, amely indukálja a promotor-aktivitást, olyan menynyiségben, amely egy jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan replikációhoz vezet. Ha kívánatos, ezeket a tenyésztési körülményeket vissza lehet fordítani egy olyan időtartam után, amely elegendő a plazmid jelentős mennyiség-növeléséhez, de elegendően rövid a mikrobiológiai tenéyszet bármiféle károsodásának elkerüléséhez, olyan módon, hogy a vegyületet eltávolítjuk a tápközegből; ez a plazmid-kópiaszám lassú csökkenéséhez vezet egészen addig, amíg az ténylegesen eléri az indukció előtti szintet. Ebben a szövegösszefüggésben az .eltávolítjuk' kifejezés nem szükségszerűen jelenti a szóban forgó vegyület teljes távollétét a tápközegböl, hanem csak csökkenést a vegyület koncetréciójában olyan mértékig, ahol ennek tovább már nincs hatása. Egy másik módszerben, amely bizonyos vegyületek által inkább gátolt, mint indukált promotort alkalmaz, a mikrobiológiai tenyészetet kezdetben a szóbanforgó alkalmazott promoter aktivitását gátló vegyület jelenlétében tenyésztjük, ez után a vegyület koncentrációját csökkentjük, pl. a tápközeg hígításával vagy a sejtek által történő fokozatos elfogyasztással olyan mértékig, amely a promoter aktiválásához vezet, így idézve elő egy jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid kópiaszáraot. Ha kívánatos, a tenyésztési körülményeket vissza lehet fordítani egy olyan időtartam után, amely elegendő a plazmid jelentős mennyiségnöveléséhez, de elegendően rövid a mikrobiológiai tenyészet bármiféle károsodásának elkerüléséhez, olyan módon, hogy promotor aktivitást gátló vegyületet adunk hozzá olyan mennyiségben, amely a plazmid kópiaszám lassú csökkenéséhez vezet egészen addig, amig el nem éri az indukció előtti szintet. Azok a körülmények, amelyek közt a mikroorganizmusok növekednek, magukba foglalhatják a tenyésztésnek legalább egy periódusát, amely olyan vagy közel olyan hőmérsékleten megy végbe, amelynél a plazmid kópiaszáma lényegesen megnövekedett vagy szabályozatlanná vált. Ha a szabályozható promotor hőmérsékletfüggő vagy egy hőmérséklet-érzékeny faktorral szabályozott, előnyös a találmány szerinti plazmiddal transzformált mikroorganizmus szaporítását egészen a termelő méretű tenyészetig olyan vagy közel olyan hőmérsékleten végezni, amelynél a plazmid konstans, kis kópiaszámot mutat, abból a célból, hogy elkerüljük a mikrobiológiai növekedés bármiféle gátlását egy megnövekedett plazmid- és gén-termék koncentrációval. Ez után a hőmérsékletet feljebb visszük arra a hőmérsékletre, amelynél a plazmid jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan kópiaszómot mutat. Egy megfelelő termelő periódus utón, gyakran addig, amíg a mikroorganizmus növekedését a plazmidból eredő plazmid DNS és/vagy gén-termékek termelése nem gátolja, elvégezzük a gén-termék kinyerését. A szóban forgó körülményektől függően kívánatos a termelő tenyésztést folyamatosan azon a hőmérsékleten végrehajtani, amely csupán megközelíti azt a hőmérsékletet, amelynél a plazmid kópiaszáma lényegesen megnövekedett vagy szabályozatlan, így lehetséges a gazda-mikroorganizmus túlélése és folytonos 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
