201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
15 HU 201116 B 16 fejteni a deo promotorból származó kifejeződésre a katabolit represszió hatásán keresztül. A crp (katabolit represszor fehérje) aktiválása ciklikus AMP-vel (cAMP) a deo promoter aktivitás stimulálását eredményezi; a cAMP nagy celluláris szintjéről ismeretes, hogy korrelációban van a glükóz alacsony szintjével vagy hiányával a növekedési tápközegben, ezt úgy lehet elérni, hogy csak korlátozott mennyiségű glükózt adunk a tápközeghez, azaz mintegy 0,01% mennyiségét, más szénforrásokkal, pl. glicerinnel vagy szukcináttal együtt. Amikor a glükózt elfogyasztotta a sejt, ez a cAMP sejten belüli szintjének emelkedését eredményezi, amely viszont aktiválja a deo promotort, a promotort hordozó plazmid megnövekedett repiikációs sebességéhez vezetve. így ha a deo promotort beiktatjuk a cop B génnel ellenkező irányban az RÍ plazmid származékba, a promoter indukciója megnövekedett vagy teljesen szabályozatlan replikációhoz vezet. A szabályozatlan replikációs viselkedést vissza lehet fordítani glükóz hozzáadásával a növesztő tápközeghez úgy, hogy a plazmid kópiaszáma lassan lecsökken az indukció előtti szintre. A kémiailag szabályozható promotorra egy másik példa a lac promoter, amelyet a laktóz jelenléte indukál a tápközegben, és amely megnövekedett vagy szabályozatlan replikációhoz vezet. Ebben az esetben is visszafordítható a folyamat a tépközeghez tett laktóz mennyiségének olyan mértékű adagolásával, hogy azt a sejt minden esetben elfogyassza. A szabályozható promotort hordozó DNS megfelelő helyzetben és irányban történő beiktatása egy természetes replikációs szabályozó gén egy részének helyébe, pl. az RÍ plazmid cop B génjének egy részét fedő Bgl II fragmens helyébe, egy olyan plazmid-származékot eredményez, amelynek replikációs sebességét legalább részben a beiktatott promoter szabályozza (A típusú plazmid). Egy, a természetes replikációs szabályozó génnel, RÍ plazmid származékok esetében a cop B génnel, közvetlenül ellenkező irányú szabályozható promotort hordozó DNS fragmens beiktatása egy olyan plazmidot eredményez, amelynek replikációs tulajdonságai kissé különbözőek (B típusú plazmid). Amint fentebb említettük, a B típusú plazmidok, amelyek nem tartalmaznak par területet, mintegy 1%/generáció gyakorisággal elvesznek. A plazmid jelenlétére történő szelekció nélkül a tenyészetben a plazmid végül el is tűnik a kb. 30 °C hőmérsékleten nőtt sejtekből. Abból a célból, hogy a plazmidot stabilizáljuk, lehetséges egy par területet hordozó DNS fragmens beiktatása pl. egy vad-tipusú RÍ plazmidból egy B típusú plazmidba, amely a hasonló körülmények között növesztett sejtekből eredő plazmid teljes (veszteség nélküli) stabilitáséhoz vezet. A plazmid stabilitását úgy lehet meghatározni, hogy olyan B típusú plazmidot tartalmazó sejteket, amely plazmidba lac gént, valamint par területet iktattunk be, és kontrollként lac gént hordozó, de par területet nem hordozó B típusú plazmidot tartalmazó sejteket szelektíven növesztünk antibiotikumot (amelyre a plazmid rezisztenciát közvetít) tartalmazó lemezeken, hogy mindkét fajta plazmid jelenlétét biztosítsuk a kiindulási telepek közt. Mindkét telep mintáit semmiféle antibiotikumot sem tartalmazó lemezekre szélesztjük úgy, hogy a sejteket hagyjuk nőni generációk (sejt-kettőződések) során, pl. 25 generáción keresztül. Végül az így keletkezett telepek mindkét fajtájából származó sejteket McConkey laktóz indikátor lemezekre szélesztjük, ahol azok a sejtek, amelyek eredetileg is tartalmaztak par területet hordozó plazmidokat, vörös telepeket képeznek, ez azt mutatja, hogy a plazmid megőrződött, míg a kontroll sejtek, amelyek eredetileg par terület nélküli plazmidokat tartalmaztak, mind vörös, mind színtelen telepeket képeztek, amely azt jelenti, hogy a szelekció-mentes periódus során a plazmid jónéhány sejtből eltűnt. így azt lehet demonstrálni, hogy azok a plazmidok, amelyekbe par terület volt beiktatva, tökéletesen stabillá váltak (lásd 11. példa). Ez a stabilizáló hatás különösen fontos, ha egy beiktatott DNS fragmens csökkenést okoz a plazmid-hordozó sejt növekedési sebességében a plazmid-mentes sejtekhez viszonyítva. Végül a természetes replikációs szabályozó gént, pl. az RÍ plazmid cop B génjét hordozó DNS fragmens beiktatása egy, az A típusú plazmid replikációs területein kívüli helyre egy különleges replikációs tulajdonságú plazmidot eredményez (C típusú plazmid). A fentebb leírt B plazmidokra vonatkozó plazmid-stabilitási szükségesség még sokkal hangsúlyozottabb ott, ahol C típusú plazmidokról van szó, mivel ezek, mint korábban említettük, még kisebb kópia-számmal rendelkeznek alacsony hőmérsékleten, és ezért nagyobb gyakorisággal tűnnek el, mint a B típusú plazmidok, ha a par-területük hiányzik. A C típusú plazmidokat hasonló módon lehet stabilizálni, vagyis a par terület beiktatásával a plazmidokba olyan plazmidok esetében, ahol az még nincs jelen. A találmány egy sajátos megvalósítási módja szerint a plazmid az első szabályozható promotoron kívül egy második promotort is hordoz, amely a replikációs területen kívül helyezkedik el, ez a második promoter egy beiktatott strukturgén kifejeződését szabályozza, amely pl. egy kívánt polipeptidet kódol. Ez a második promoter lehet pl. a cl promoter, amely a aPr promotort és a ol gént is hordozó fragmensen helyezkedik el, amely cl promotort a cl gén terméke szabályozza, és amely cl promoter a APR-rel ellenkező irányban ir át. A cl promotorral egy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
