201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
13 HU 201116 ß 14 replikációs inhibitorként, azaz jelentősen inaktivélódott, megnövekedett mennyiségű Rep A fehérjéhez és esetleg megnövekedett plazmid kópiaszámhoz vezetve (SLoug&ard és munkatársai: EMBO Journal 1, 1982, 323-328). A replikáció szabályozása A két gén, a cop A és cop B termékei negatívan szabályozzák az RÍ plazmid replikéciójót, azaz replikációs inhibitorként funkcionálnak. A rep A-lac fúziók megalkotása és analízise során az volt demonstrálható, hogy a két cop géntermék a rep A gén kifejeződésének negativ szabályozásával működik (Light és Molin: Mol. Gen. Genet. 184, 1981, 56-61). Ennél fogva az RÍ plazmid replikációját, úgy tűnik, egy olyan fehérje képződésének szabályozásával lehet szabályozni, amely pozitívan szükséges - valószínűleg a plazmid replikóciójának beindításához. A lac gén fúziók segítségével az is demonstrálható volt, hogy a cop A és cop B termékeknek más a célpontjuk. A Cop B fehérjéhez tartozó célpont a rep A promoter, ahol ez az átirás beindításának gátlásával működik. A Cop B fehérje azonban képtelen kölcsönhatásba lépni a rep A promotorral ellenkező irányban megkezdett átírással. A Cop A-RNS nem hat az átírásra, hanem az átírás utáni szinten működik, azaz a Rep A-mRNS fordítás gátlásával. A .megvaduló" mutánsok replikációja A 78.101 877.5 számú, publikált Európa Szabadalom bejelentésben foglalt plazmidok replikációs rendszere lényegileg azonos a fentebb leírtakkal a vad-típusú RÍ plazmidokra való tekintettel. A jelen feltalálók mostani kutatásai részben megállapították az okét a .megvaduló* replikációs viselkedésű, hőmérséklet-függő plazmid-mutánsok létezésének. Amint korábban magyaráztuk, a megnövekedett átirás a rep A gén felé a Cop A RNS molekula inaktiválódásához vezethet. A fentebb említett szabadalmi bejelentésben foglalt .megvaduló" mutáns plazmidokban a cop B promoter mutációt szenved, a szekvenciában egy egyedi nukleotid helyettesítésével, amint ez a következőkben látható: a.) vad típusú plazmid: 5’-..... . TTC TCA AGT (Cj GCT ...-3’ b.) .megvaduló" plazmid: 5’-..... .. TTC TCA AGT [t) GCT ...-3’. A bekeretezett jelek mutatják a nukleotidhelyettesítést. A fent ábrázolt terület az RNS polimeráz kötő-hely. Úgy találtuk, hogy a mutáció okozza a cop B promoter megnövekedett átírását, elsősorban magasabb hőmérsékleteken. Szabályozható promotort hordozó plazmidok replikációja. A jelen találmány szerinti plazmidok megalkotásában a feltalálók nemrégiben a vad-típusú RÍ plazmid replikációs rendszeréről megszerzett ismereteiket hasznosították. A jelen találmány szerinti plazmidok replikációja azonban nem a plazmidban történő mutációra támaszkodik, mint a publikált 78.101 877.5 Európa Szabadalom bejelentésben foglalt .megvaduló" plazmid esetében. E helyett egy idegen promoter van beiktatva úgy, hogy a replikációs terület átírását legalábbis részben ebből a promotorból szabályozzák. A promoter szabályozható lehet azoknak a körülményeknek a beállításával, amelyek között a gazda mikroorganizmus növekszik, és a promoter aktivitás szabályozására különböző módokon lehet hatni, mint pl. a tenyésztési hőmérséklet vagy a növesztő tápközeg-összetétel változtatásával. Amikor a szabályozható promoter olyan, amelyet a hőmérsékletfüggő promotorok csoportjából választottunk ki, előnyös egy olyan promoter, amely a A bakteriofágból származik, mint pl. a aPb vagy aPl, előnyösen a aPb. A a fágban a Pb promoter a cl represzszorral szabályozható, amely a találmány alapelveivel összhangban a A fágból származik a APB-rel együtt, és amely egy plazmidba van beiktatva egy Bgl II fragmens formájában (lásd a mellékelt plazmid-térképeket a 4- -11. ábrákban). A vad-tipusú cl represszor önmagában nem hőmérséklet-érzékeny, igy abból a célból, hogy a replikációs rendszert a tenyésztési hőmérséklet beállításénak segítségével szabályozhatóvá tegyük, a fajlagos cl represszort (lásd a következő példát), amelyet a cls57 mutáns alléi kódol, alkalmazzuk (Sussman és Jacob: Compt. Rend. Acad. Sei. 254, 1962, 1517). A represszor aktív, azaz represszálja a aPb promotort, alacsony hőmérsékleten, pl. 30 °C hőmérsékleten, míg magasabb hőmérsékleten, pl. 39 °C hőmérséklet fölött ez denaturálódik és a represszor funkció inaktiválódását és a aPb derepreszszióját idézi elő. Mivel a beiktatott promoter igen erős, ez drasztikusan megnövekedett átírást eredményez a rep A irányában, amely viszont a szabályozatlan plazmid-replikációhoz vezet. Egy másik változat szerint a promoter szabályozására kémiai úton lehet hatni, azaz vagy azon tápközegnek összetételének a beállításával, amelyben a gazda-mikroorganizmus nő, vagy a promotort indukáló kémiai anyag hozzáadáséval, pl. a promoter aktivitását és következésképpen a promoter derepresszióját szabályozó represszor inaktiválását idézve elő vagy egy, a promoter aktiválásához vezető promotor-indukáló metabolit képződését biztosítva. A kémiailag indukálható promotorok ra jellemző példa az E. coli-ból származó deo promoter, amely két kromoszomális represszor-fehérjével, a deo R és cyt R gének termékeivel történő negatív szabályozás tárgya. A deo promotort a citidinnek a nővesztő tápközeghez történő hozzáadáséval lehet derepresszálni, mivel a citidin affinitást mutat a represszorhoz, konformációs változásokat okozva azon úgy, hogy a represszorként való működését beszünteti. Ezen felül pozitív szabályozást is ki lehet 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
