201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
11 HU 201116 B 12 Rl-típusú plazmidok replikéciós szabályozó rendszere. Az alap-replikon A legutóbbi időkig az RÍ tipusú plazmidok replikációs szabályozó rendszere nem volt ismeretes. Azt találtuk, hogy az RÍ plazmid replikációjához és a replikáció szabályozásához szükséges genetikai információt egy 2500 bázispár hosszúságú terület hordozza, amely három, a rezisztencia-átviteli faktoron belül elhelyezkedő Pst I fragmenst tartalmaz (Molin és munkatársai, J. Bact. 138, 1979, 70- -79). Ezt a területet alap-replikonként definiáljuk, ez négy fontos elemet tartalmaz, három gént (cop A, cop B és rep A) és a replikációs beindítást (Molin és munkatársai: Microbiology, 1981, 408—11). Az alap-replikon fizikai, genetikai és működési térképét az 1. ábrában mutatjuk be. A rep A gén kódolja azt a funkciót, amely pozitívan szükséges a replikációhoz. A gén-termék (a DNS-szekvencia alapján) egy 278 aminosavból álló fehérje, amelynek molekulatömege kb. 33000 dalton (Rosen és munkatársai: Mol. Gen. Genet. 179, 1980, 927-37). Ezt a fehérjét egyértelműen még nem azonosították, de az a képesség, hogy fehérjét képezzen a rep A génből, világosan demonstrálva van az átíró gén lac 2 génnel történő fúziójának alkalmazáséval (Light és Molin: Mol. Gen. Genet. 184, 1981, 56-61). A Rep A fehérje biokémiai funkciója még nincs teljesen feltárva, de úgy vélhető, hogy a Rep A fehérje egy replikéciót beindító faktor. A cop A gén egy kis (80-90 nukleotid hosszúságú) nem stabil RNS molekulát kódol, amelynek nagy méretű szekunder szerkezete van (azaz hajtű-hurkokat képez) (Stougaard és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, 1981, 6008-6012). A Cop A-RNS a replikáció inhibitora; a Cop A-RNS nukleotid-szekvenciéjára ható mutációk egy megnövekedett kópiaszámhoz vezethetnek (cop-mutánsok). A cop A mutánsok DNS-szekvencia-analizise azt mutatja, hogy minden mutáció meglepően a hurok-területen csoportosul 5 bázison belül. Ezek a mutációk a vad-tipusú plazmid elleni inhibitor-aktivitás drasztikus csökkentését vagy teljes elvesztését eredményezik. Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy az inhibitor-fajlagosság a hurokban foglal helyet. Az is meglepő, hogy az összes cop A mutánsban, amelynek nukleotid-szekvenciája ismert, a Cop A-RNS-ben levő citozin uracillal van helyettesítve (vagy, egyetlen esetben, adeninnel). Ez erősen sugallja, hogy a Cop A-RNS nukleinsav/nukleinsav interakcióval működik. Ezt a következtetést tovább erősíti az a tény, hogy még azok a cop A mutánsok, amelyek az összes Cop A aktivitást elvesztették a vad-típusú plazmidok ellen, megőriznek bizonyos Cop A aktivitást egymás ellen. Sőt, a vad-típusú Cop A-RNS a leggyakrabban csökkenti az inhibitor-hatást a cop A mutáns plazmidok ellen. Ennél fogva egy cop A mutáns nem csupán az inhibitorban változik, hanem a cél-tárgyban, a cop T-ben is; egy egyedi bázis-helyettesités igy egy olyan végeredményhez vezet, amely fenotípusosan kettős mutáns. A cop B gén egy 86 aminosavból álló, 11000 dalton molekulatömegű alap-fehérjét kódol. Ezt a fehérjét jelentős mennyiségben képezi. A cop B gén kiiktatása a promotorjából nyolcszoros növekedéshez vezet a kópia-számban; ennél fogva arra a következtetésre lehet jutni, hogy a cop B fehérje replikációs inhibitorként hat, azaz az RÍ plazmid replikációjának szabályozóséban negatívan működő szabályozó elemként (Molin és munkatársai: Mol. Gen. Genet. 181, 1981, 123-30). Egy kettős mutáns (cop A cop B) feltétlenül letális hatású a gazda-mikroorganizmusra az úgynevezett .megvaduló" replikáció következtében. Ennél fogva a két szabályozó gén-termék szinergetikusan működik. Átirási aktivitás az alap-replikonban Három átírást beindító hely van az alap-replikonon belül: cop B promotor, a rep A promotor (Light és Molin: Mol. Gen. Genet. 184, 1981, 56-61) és a cop A génhez tartozó promoter (Stougaard és munkatársai, korábban idézett közlemény). Az utóbbi a kezdő (origin) területtől távol ír át, mig a két előbbi a kezdő terület felé ír át. Következésképpen mindkét szél a cop A területen íródik át. A Cop B átírás folytatódik a cop B génen túl, és ez az átirat, valamint az az átirat, amely a rep A promotornál indul, mindketten átírják a rep A gént. A Bgl II-vel történő hasítással létrehozott cop B génkiiktatás 8-10-szeresen megnövekedett RÍ plazmid kópiaszámot eredményez. Ez meglepő, mivel a cop B gén promotort és a cop B strukturgén központi részét kiiktatjuk, amely azt eredményezi, hogy 1.) a cop B aktivitás és a rep A promoter derepresszió elvész, és 2.) a cop B promoter részesedése a teljes rep A kifejeződésre elvész úgy, hogy a derepresszált rep A promoter eredményesen átvállalja a teljes rep A átírást a cop B promotorból. A teljes hatás csupán kétszeres növekedés lehetne a rep A gén átírásának sebességében, mivel a rep A promotornak olyan az erőssége, amely kétszeresen megnövekedett a cop B promoter erősségéhez viszonyítva. Ezt a nyilvánvaló ellentmondást a cop A gén aktivitása magyarázza. A Cop A-RNS egy normál befejező szerkezetben végződik egy nyél-végződéssel az U-k sorozatában. A Rep A fehérje képződésének Cop A-RNS eredetű szabályozása az ilyen megfelelő végződéstől függ. Ha az ellentétes szál átírása erős (konvergens átírás), a végződés hatékonysága csökken. A rep A promotorból származó megnövekedett átírás a Cop A átirat kiterjesztését eredményezi kb. 150-200 nukleotiddal. A kiterjesztett Cop A átirat nem funkcionál 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
