201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
5 HU 201116 B 6 ban aPh. Más, a jelen találmány alapelveivel összhangban levő plazmidba beiktatott és a hőmérséklettől eltérő, más külső tényezők által befolyásolt promotor-rendszerek is alkalmazhatók, mint pl. olyan promotorok, amelyek vegyszerekkel indukálhatok vagy amelyek metabolitok segítségével szabályozhatók, mint pl. a lac, trp vagy deo promotorok. A találmány szerinti plazmid egy kedvező kiviteli formája az, amelyben a promotor-szabályozó rendszer a plazmid hőmérsékletfüggő replikációs viselkedését idézi elő. Pontosabban, az a hőmérséklet, amelynél a plazmid lényegesen megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid kópiaszámot mutat, nagyobb, mint az a hőmérséklet, amelynél a kópiaszám kicsi. A találmány szerinti plazmidok, amelyek egy olyan szabályozható promotort hordoznak, amelynek átírási sablonja hőmérsékletfüggő, pl. egy hómérsékletérzékeny represszor miatt, egyik hőmérsékletnél konstans, kis kópiaszámot mutatnak, mint pl. kb. 30 °C hőmérsékletnél, mivel ennél a hőmérsékletnél a promoter represszálva van és az átírás ebből következésképpen alacsony szinten marad, míg egy nagyobb hőmérsékletnél, pl. 36-42 °C hőmérsékletek között, jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan kópiaszámot mutatnak, mivel a szabályozó rendszer ennél a hőmérséklet-tartománynál inaktiválódik a promoter depresszálódását és következésképpen a promotorból megnövekedett átírást okozva. Előnyös, ha a .megvaduló' replikáció 39 °C hőmérséklet fölött történik. A továbbiakban a leírásban csupán olyan plazmidokra hivatkozunk, amelyek replikációját olyan szabályozó rendszer szabályozza, amely hőmérséklet-érzékeny, elsősorban egy hőmérséklet-érzékeny represszor, bár megérthető, hogy más típusú feltételek, amelyek segítségével a plazmid replikációja szabályozható, szintén hasznosíthatók analóg módon, amint ezt a korábbiakban megmagyaráztuk. A találmány szerinti plazmidok egyik típusa egy olyan plazmid, amelyben egy szabályozható promoter van beiktatva a plazmid egyik természetes replikációs szabályozó génje helyébe. A jelen leírás és igénypontok céljaira az ilyen plazmidokat A típusú plazmidnak nevezzük. Amikor a plazmid egy RÍ plazmid származéka, a plazmidból kiiktatott regulátor-gén a cop B gén, ez kódolja a plazmid természetes replikációs inhibitorainak egyikét. A cop B gén kiiktatása 20-40, előnyösen 20-30, még előnyösebben 20-25 kópia/sejt kópiaszámot eredményez, kb. 30 °C hőmérsékleten. Amikor azonban a hőmérséklet mintegy 40 °C-ra emelkedik, a szabályozható promoter represszor-funkciója inaktiválódik és a replikáció szabályozatlanná válik, egy legalább 500-1000 kópia/sejt tartományban levő plazmid-kópiaszámot eredményezve, többek között a plazmidba beiktatott bármilyen idegen DNS méretétől (minél nagyobb a DNS fragmens, annál kisebb a képződött plazmid-kópiák száma), az ilyen idegen gén-termékek hatásától és/vagy a mikroorganizmus törzstől függően, amelybe a plazmidot transzformáljuk. Bizonyos esetekben azonban a plazmid több ezer kópiát is képezhet sejtenként magasabb hőmérsékleten. Mindenesetre a plazmid DNS-tartalom nagy hőmérsékleten a teljes DNS tartalomhoz viszonyítva mintegy 40-75%, általában 50-60%. A találmány szerinti plazmidok egy másik típusa egy olyan plazmid, amelynek kópiaszáma 3-5/sejt az egyik hőmérsékleten, pl. 30 °C hőmérsékleten, és kópiaszáma szabályozatlan, legalább 500-1000 kópia/sejt tartományban van a fentebb körvonalazott tényezőktől függően, és bizonyos esetekben a több ezer kópia/sejt értéket is eléri nagyobb hőmérsékleten, pl. 42 °C hőmérsékleten. Ilyen plazmidokat lehet nyerni úgy, hogy a szabályozható promotert a plazmid természetes replikációt szabályozó génje(i)vel ellentétes irányban iktatjuk be. A jelen leírás és igénypontok céljaira az ilyen plazmidot B típusú plazmidnak jelöljük. RÍ plazmid származék esetében a szabályozható promotort mind a cop B, mind a cop A génekkel ellenkező irányban iktatjuk be, úgy mindezek a természetes replikációs inhibitorok megőrződnek, amely azt eredményezi, hogy a plazmidok a fentebb említett kópiaszám sablont mutatják. Ha azonban a plazmid olyan, amelyből a par terület hiányzik (ennek a megosztásért felelős területnek a jelenléte a plazmidban olyan hatást okoz, hogy a plazmid stabilan öröklődik; ez a hatás a par területen levő egy vagy több génnek tudható be), a plazmid kb. 1%/generác.ió gyakorisággal elvész az alacsony hőmérsékleten az alacsony hőmérsékletnél levő kis kópiaszám miatt. Következésképpen előnyös lenne a par területet beiktatni egy ilyen plazmidba, ilyen módon biztosítani, hogy a plazmid .megvaduló" replikéciója ezt követően végbe tudjon menni a populáció minden sejtjében. A B típusú plazmidnak a nagy kópiaszámú tartománnyal szemben további előnyei vannak. Mivel a kópiaszám alacsony hőmérsékleten nagyon kicsi, lehetséges olyan idegen géneket beiktatni a plazmidba, amelynek termékei részben toxikusak (csökkentve a növekedési sebességet) vagy akár letálisak is lehetnek arra a mikroorganizmusra, amelybe a plazmidot transzformáljuk. Ez néha előfordul az eukarióta génekből származó termékek esetében, amelyek általában a legérdekesebbek, pl. a gyógyszeripar területén. Az alacsony hőmérsékleten levő kis replikációs sebesség miatt az idegen gének vagy egyáltalán nem fejeződnek ki, vagy csupán igen kis mennyiségben, úgy, hogy a sejtek ezáltal nem károsodnak és kis hőmérsékleten normális feltételek mellett növekedhetnek. Ez nagymértékben növeli vagy megkönnyíti bizonyos polipeptidek előállításénak folyama5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
