201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
7 HU 201116 B 8 tát, amelyeket egyébként nem vagy csak nagy nehézségek árán lehet előállítani. A találmány szerinti plazmidok egy harmadik típusa egy olyan plazmid, amelynek kópiaszáma 0,5-1 kópia/sejt tartományban van (a 0,5 számot úgy kell érteni, hogy a replikáció frekvenciája kevesebb, mint egy sejt/ciklus) az egyik hőmérsékleten, pl. 30 °C hőmérsékleten, és szabályozatlan a kópiaszáma, vagyis legalább 500-1000 kópia/sejt tartományban van, a korábban körvonalazott tényezőktől függően, és bizonyos esetekben elérheti a több ezer kópia/sejt értéket, magasabb hőmérsékleten, pl. 42 °C hőmérsékleten. Ilyen plazmid lehet egy olyan plazmid, amely a replikációs területen azt a szabályozható promotort hordozza, amelyből az egyik természetes replikációs szabályozó gén egy része ki lett iktatva, amely azután be lett iktatva a replikációs területen kívül, azaz egy olyan helyen, ahol természet szerint nem helyezkedne el. A jelen leírás és igénypontok céljára ezt a plazmidot C típusú plazmidnak nevezzük. RÍ plazmidszármazékok esetében, amelyből a cop B gén ki lett iktatva, a cop B gént újból beiktatjuk, nem eredeti helyére, hanem az EcoRl helynél, a replikációs területen kivül. A cop B inhibitor fehérje ugyan befolyásolja a plazmid replikációját, de olyan- módon, hogy a plazmid a fentebb említett kópiaszám-sablont mutatja. Ha azonban a plazmid olyan plazmid, amelyben a par terület hiányzik, a plazmid kb. 5%) generáció gyakorisággal elvész alacsony hőmérsékleten a rendkívül kicsiny kópiaszám miatt. Következésképpen ennél a plazmidnál még előnyösebb, mint a B típusú plazmidok esetében, par területet iktatni a plazmidba, hogy biztosítani tudjuk, hogy a plazmid .megvaduló' replikációja ez után megtörténhessen a populáció minden sejtjében. A replikációs viselkedés a kis illetve nagy hőmérsékleten, emiatt ennek a plazmidnak az előnyös alkalmazása egyébként hasonló a B típusú plazmid tulajdonságaihoz. A találmány egy második megjelenési formája egy olyan plazmidra vonatkozik, amelyben a replikációs területből történő átírást szabályozó első szabályozható promotoron kívül egy második promotor is be van iktatva olyan módon, hogy ez lehetővé teszi egy olyan strukturgén beiktatását, amelynek kifejeződését a második promotor szabályozza. Ez a második promotor szabályozható, vagyis lehetséges szabályozni a funkcióját azoknak a körülményeknek a beállításával, amelyek között a gazdasejt növekszik, hasonló módon, mint ahogyan az első szabályozható promotor szabályozásánál történt. Egy sor promotort lehet jelenleg használhatónak ítélni erre a célra, mint pl. a lac promotort, trp promotort, deo promotort, rec A promotort, aPl promotort, stb. A aPi promotor bizonyulhat különösen előnyösnek második promotorként a strukturgén kifejeződésének szabályozására, mivel ezt is a hőmérsékletérzékeny cl represszor szabályozza és ezért a mennyiség-növelési feltételek azonosak, úgy, hogy a gazdasejt tenyésztése egyszerűsödik és a termék-mennyiség-nővelés párhuzamosan történik a plazmid DNS menyny iség-növelésé vei. A második promotort be lehet iktatni az A, B és C típusú plazmidokba egyaránt. Egy ilyen plazmid konstans, kis kópiaszámmal rendelkezik, és nagyon kevés a gén-kifejeződés 30 °C hőmérsékleten, vagy egyáltalán nincs, és az ezt követő megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid kópiaszám és génkifejezódés van jelen a 36-42 °C hömérséklet-tartományban. Előnyösen a plazmidnak 39 °C fölötti hőmérsékleten van szabályozatlan kópiaszáma és nagyon nagy gén-kifejeződése. A találmány szerinti plazmidokat fel lehet használni klónozó és termelő vektorként, vagyis a plazmidokat fel lehet használni a rekombináns DNS technológia területén technikai és orvosi célú termékek széles választéka nyerésének céljából; közülük a polipeptidek és fehérjék vagy ezek fragmensei, enzimek és az enzimek reakcióinak nem fehérje-szerű termékei a tápközegben levő vegyületből, kis molekulatömegű termékek, mint pl. hormonok és nukleinsavak; eukarióta, főként emlős gének termékei a különösen érdekesek. Klónozó vagy termelő vektorként történő felhasználáshoz előnyös, de nem kötelező, ha a plazmid, legalább egy restrikciós endonukleáznál, egy ezzel az endonukleázzal hasítható egyedi hellyel rendelkezik. Ez a hely legyen olyan hely, amely az idegen DNS fragmens beiktatásánál engedje meg a keletkezett rekombináns plazmid autonom replikálódását, és engedje meg a plazmidba beiktatott szabályozható promotornak, hogy szabályozza a replikációs terület átírását, ilyen módon - amikor az átírás ebből a promotorból növekszik - egy lényegesen megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid-kópiaszámhoz vezetve. A replikációs területen elhelyezkedő restrikciós helyek így nem fogadhatók el klónozó helyekként, mivel ez a plazmidban a replikációs tulajdonságok elvesztését okozná. A találmány szerinti plazmidot olyan módszerrel hozzuk létre, amely magában foglalja egy szabályozható promotor beiktatását egy plazmidba oly módon, hogy az ebből a promotorból történő átírás szabályozza a replikációt, valamint az így kezelt plazmid azonosítását olyan módon, hogy kiválogatjuk (screeneléssel) azokat a plazmidokat, amelyek lényegesen megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid-kópiaszámot mutatnak, amikor a promotorból történő átírás növekszik. Amikor a szabályozható promotor aPr, ezt be lehet iktatni a megfelelő endonukleázzal hasított plazmid és a fág DNS összekeverésével, hőinaktiválásával, és a keverék kötésével (ligá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
