201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
3 HU 201116 B 4 nyegesen megnövekedett vagy szabályozatlan kópiaszámhoz vezet. A jelen leírásban és igénypontokban a .szabályozható promotor* kifejezés egy olyan promotorra vonatkozik, amelynek aktivitását, az átírás beindításának sebességére tekintettel, szabályozni lehet azoknak a feltételeknek a megválasztása segítségével, amelyek közt a promotor-hordozó plazmidokat tartalmazó gazda-mikroorganizmusok növekszenek. Egy ilyen szabályozható promotor lehet egy idegen promotor, amely természet szerint nem rokon azzal a plazmiddal, amelybe beiktatják. A promotor lehet vele születetten szabályozható egy ide illő DNS szerkezet következtében a promotor területén belül. Egy ilyen promotorra példa az egyik olyan promotor, amelyet az ismert .megvaduló* plazmidban találtak (lásd később a leírást). Egy másik változat szerint a promotor lehet szabályozható egy szabályozó faktor segítségével, amely vagy pozitív ellenőrzéssel hat, vagyis a plazmid nem lép be a szabályozatlan replikációba, hacsak a promotort pozitívan nem indukálják, pl. egy indukáló vegyület hozzáadásával a tápközeghez, amelyben a gazdasejtek növekednek; vagy a szabályozó faktor negatív ellenőrzéssel hat. Az utóbbi típusú szabályozó faktor is ismert, mint egy represszor, amelynek aktivitása is lehet szabályozható a gazdasejt növesztési feltételeinek beállítása segítségével. A represszor gén elhelyezkedhet a plazmidon magán a promotorral együtt, vagy egy külön plazmidon ugyanabban a gazda-mikroorganizmusban vagy a gazda-mikroorganizmus kromoszómájában. A represszor gén olyan terméket kódol, amely gátolja az átírást a beiktatott promotorból úgy, hogy a replikációt alacsony, állandó szinten tartja. Amikor valamilyen okból a represszor inaktívvá válik, az ilyen szabályozás nem áll fenn, és az átírás növekszik. Hacsak másképpen nem jelezzük, a .promotor* kifejezés, amelyet a jelen leírásban és igénypontokban használunk, általában jelenthet egy olyan promotort, amelynek aktivitása öröklött módon válaszol a gazdasejt növekedési feltételeinek változásaira, de jelent egy olyan promotort is, amelyet egy szabályozó faktor szabályoz. Az a kifejezés, hogy .egy plazmid, amelybe szabályozható promotor van beiktatva* azt kívánja jelenteni, hogy olyan találmány szerinti plazmidról van szó, amelyben a promotor és a promotor által szabályozott replikon be van iktatva ugyanabba a DNS fragmensbe, a promotor és a replikon végül is különböző forrásokból származik; ez azt jelenti, hogy a kívánt végleges plazmid megalkotásának során az egyik szakaszban a promotort beiktatják abba a plazmidba, amelyből a replikon származott. Azt a kifejezést, hogy .lényegesen megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid kópiaszám* úgy lehet érteni, hogy ez arra a tényre utal, hogy amikor a gazda-mikroorganizmus növesztéséhez alkalmazott feltételek változnak abból a célból, hogy a promotorból megnövekedett átírás legyen biztosítható olyan módon, hogy a plazmid elveszti replikációs szabályozását, a plazmid kópiaszám exponenciálisan növekszik a mikrobiológiai populáció mintegy 40-50%-os vagy még kisebb generációs idejével. A kópiaszámban növekedés addig folytatódik, amíg a gazdasejt abbahagyja a növekedést, általában 4-5 sejt-kettózödés vagy ennél kevesebb után, ennél a pontnál a plazmid DNS tartalom a sejtben mintegy 40-70%-a a teljes DNS menynyiségnek, vagyis a plazmid kópiaszáma egy 25-1000 közti vagy még nagyobb faktorral növekszik. Más szavakkal a plazmid kópiaszáma nem ér el állandósult állapotot. A szabályozatlan replikációs viselkedésnek azt a típusát .megvaduló* viselkedésnek is nevezzük. Az RÍ típusú plazmidok replikációs szabályozásának alapelveire vonatkozó ismereteinket hasznosítjuk a találmány szerinti plazmidok megalkotásában (ennek az alapelvnek további magyarázatát lásd a találmány részletes leírásánál). Amikor a találmány alapelvével összhangban egy szabályozható promotort iktatunk a plazmidba, a promotorból eredő megnövekedett átírást, amely egy jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan plazmid kópiaszámhoz vezet, okozhatja pl. a promotor depressziója. Ez azt jelenti, hogy a promotorral együtt beiktatott represszor gén, amely a bizonyos körülmények között szabályozó gént kódolja, inaktívvá válik bizonyos más körülmények között, úgy, hogy az átírást a promotor tovább nem gátolja, ez végül is egy szabályozatlan plazmid kópiaszámot eredményez. Ez jelentős javítás az ismert .megvaduló* plazmidokhoz hasonlítva, amelyek változó körülmények között különbségeket mutathatnak replikációs tulajdonságaikban. Nincs jele annak, hogy a találmány szerinti plazmidokkal is ez lenne a helyzet, mivel a beiktatott idegen promotorok általában olyanok, amelyek olyan erősek (vagyis az átírás beindításának frekvenciája olyan nagy), hogy ilyen körülmény-változások hatástalanok. A tenyésztés körülményeinek egyike, amelynek segítségével a szabályozható promotor aktivitását szabályozni lehet, az a hőmérséklet, amelynél a gazda-mikroorganizmust növesztjük. A promotor aktivitása lehet hőmérsékletfüggő önmagában, azaz a tenyésztés során reagál a hőmérséklet-változásokra, vagy a szabályozó faktor lehet hőmérséklet-érzékeny represszor. A szabályozható promotor lehet egy A- bakteriofágból származó promotor, amely promotort egy olyan DNS fragmens részeként lehet beiktatni, amely még a promotorból történő átírást szabályozó Acl hómérsékletérzékeny represszor génjét is hordozza. A a promotor lehet vagy aPh vagy aPl, elsösor-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
