201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
37 HU 201116 B 38 A plazmidot EcoRI-vel és Cla I-el emésztjük és egy pMC1403 plazmidból (Casadaban és munkatársai: J. Bact. 143, 1980, 971) származó megfelelő EcoRI - Cla I fragmenst iktatunk bele, igy nyerve a pOU93 plazmidot, amely a lac operont a deo promoter nélkül tartalmazza. Az így létrehozott Bam Hl helynél egy cop B gént hordozó Bgl II fragmenst iktatunk bele, igy nyerjük a pOU130 plazmidot (lásd 18. ábra), ezt követi az összekötés (ligáció) és a transzformáció E. coli CSH 50 törzsbe. A sejteket McConkey laktóz indikátor lemezeken, amelyek 50 pg/ml ampicillint tartalmaznak, szélesztjük és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, hogy a vörös telepeket (Lac4) szelektálhassuk. A hőmérsékletet ez 5 után 42 °C-ra visszük át, és a ű-galaktozidáz mennyiségi növekedését a 4. Táblázatban mutatjuk be. 42 °C hőmérsékleten, 45 percen át végzett inkubálás után a hőmérsékletet 38 °C 10 alá visszük. A 0-galaktozidáz mért sokszorozódását ez után a hőmérséklet-eltolás után a 4. táblázatban mutatjuk be. 4, Táblázat ű-galaktozidáz kifejeződése pOU130-ban a plazmid DNS amplifikéciója után Nővesztési feltételek ű-galaktozidáz Amplifikációs fajlagos aktivitása0 faktor 30 °C, egyenletes állapot® 0,03 1 30 °C, 42 °Cb 0,7 23 30 °C, 42 °CC, 37 °CL 2,5 83 Megjegyzések: “ pOU130-t tartalmazó CSH 50 sejtek, LB tápközegben 30 °C-on exponenciálisan növekszenek. b 30 °C-on exponenciális növekedés után a hőmérsékletet 42 °C-ra toljuk el, ahol a növesztést 2 óra hosszat folytatjuk. c 30 °C-on exponenciális növekedés után a hőmérsékletet 45 percig 42 °C-ra, majd 90 percig 37 °C-ra toljuk. d Lásd .Anyagok és módszerek'. A ű-galaktozidáz fajlagos aktivitásét Light és Molin, Mól. Gen. Genet. 1981, 56-61. oldalon ismertetett módon fejezzük ki. A táblázatból látható, hogy a gén-termék sokszorozódása jelentősen fokozódik, ha a hőmérsékletet alacsonyabb hőfokra visszaállítjuk. Ez mutatja, hogy ez a módszer különösen alkalmas arra, hogy a kérdéses gén-termék maximális kifejeződését érjük el. Mivel a 0-gáláktozidázt az ilyen gén-fúzió konstruktívan fejezi ki (Light and Molin, J. Bact. 151, 1982, 1129-1135), az enzim-aktivitás szintje pontosan mutatja a találmány szerinti plazmidok gén-termék sokszorozó kapacitását. Az E. coli CHS 50/pOU130 törzset 2759. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben. 15. példa pLC31 megalkotása és jellemzése pOU75-öt Bam HI-val elhasítunk, és egy rec A promotort és gént hordozó pBE U 14 plazmidból (Uhlin és Clark: J. Bact. 148, 1981, 386-90) származó Bam Hl fragmenst iktatunk bele, ezt transzformáció követi E. coli CSH 50 törzsbe. A cím szerinti plazmid molekulatömege 6,3.10® dalion és genotípusa a következő: rec A, bla4, cop A4, cop B*, rep A4, immA*. A plazmidot restrikciós enzimekkel feltérképezzük az 1. példában leírt módszer szerint (lásd 19. ábra). A restrikciós térké- 40 pékből kitűnik, hogy a pLC31 tartalmaz egy egyedi helyet az EcoRI restrikciós enzim számára a rec A promotorral egyező irányban, amely alkalmas idegen gének beiktatásához. 45 A pLC31-ről azt találtuk, hogy replikációs tulajdonságai azonosak a pOU71-ével. Amikor pLC31-et tartalmazó sejteket növesztünk 30 °C hőmérsékleten, a promotor teljesen represszált marad, míg a hómérsék- 50 let átállítás után 42 °C hőmérsékletre, a lex A represszor fokozatosan titrálódik és a rec A-ból eredő átírás megkezdődik, a rec A gén-termék megnövekedett mennyiségű termeléséhez vezetve, amelyet poliakrilamid gél 55 elektroforézissel ki lehet mutatni. A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázat mutatja be. Az E. coli CSH 50/pLC31 törzset 2718. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyűj- 60 teményben. 65 21
