201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
39 HU 201116 B 40 16. példa A pLC33 megalkotása és jellemzése pLC28 plazmidot (Remaut és munkatársai: Gene 15, 1981, 81-93. oldal), amely a aPl promotort és a bla gént hordozza és az EcoRl, Sma 1, Bam HI, Sal 1, Pst I és Hind III restrikciós helyeket tartalmazó összekötővel (linkerrel) van ellátva, EcoRI-vel elhasitunk és a pOU51 (lásd 1. példa) EcoRl helyére iktatjuk, ezt követi az összekötés (ligáció) és a transzformálás E. coli CSH 50 törzsbe. Ezt a plazmidot, a pLC 32’-t, amelynek molekulatömege 10,6.106 dalton, Bam HI-val és a Bal 31 exonukleázzal emésztjük, hogy az összekötőt (linkért) kiiktassuk olyan körülmények között, amelyet T. Maniatis és munkatársai leírtak (Molecular Cloning. A Laborotory Manual, Cold Spring, Harbor, New York, 1982, 135-139. oldal) ezt követi egy vissza-kötés (religáció) és a transzformálás az E. coli C 600 törzsbe (R. K. Appleyard, Genetics 39, 1954, 440-452. oldal), olyan plazmidokra szelektálva, amelyek kanamicin és ampicillin rezisztensek. A nyert plazmidot pLC33-nak jelöljük, és molekulatömege 10,3.10® dalton, genotípusa pedig a következő: cop A*, cop B", rep A*, aph A*, immA*, bla*. A plazmidot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 22. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy a aPl promoter közvetlenül az egyedi EcoRl hellyel azonos irányban helyezkedik el, a plazmidot kényelmes klónozó vektorrá teszi. A pLC33-ról azt találtuk, hogy replikációs tulajdonságai azonosak a pOU51-ével. Ennek a plazmidnak a tulajdonságait az 5. Táblázat mutatja be. Az E. coli CSH 50/pLC33 törzset 2945. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben. 17. példa A pLC34 megalkotása és jellemzése pLC28 plazmidot (Remaut és munkatársai: Gene 15, 1981, 81-93. oldal), amely a aPl promotort és a bla gént hordozza és az EcoRl, Sma I, Bam HI, Sal 1, Pst I és Hind III restrikciós helyeket tartalmazó összekötővel (linkerrel) van ellátva, EcoRI-vel elhasitunk és a pOU51 (lásd 1. példa) EcoRl helyére iktatjuk, ezt követi az összekötés (ligáció) és a transzformálás E. coli CSH 50 törzsbe. Ezt a plazmidot, a pLC 32'-t, amelynek molekulatömege 10,6.10® dalton, Bam HI-vel és Bal 31 exonukleázzal emésztjük, hogy kiiktassuk a bla gént olyan körülmények között, amelyet T. Maniatis és munkatársai leírtak (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982, 135-139. oldal), ezt követi egy visszakötés (ligáció) és transzformálás E. coli C 600 törzsbe (R. K. Appleyard, Genetics 39, 1954, 440-452. oldal), olyan plazmidokra szelektálva, amelyek kanamic.in-rezisztensek és ampicillin-érzékenyek. Az igy nyert plazmidot pLC34-nek jelöljük, ennek molekulatömege 8,4.10® dalton és genotípusa a következő: cop A*, cop B~, rep A*, aph A*, immA*. A plazmidot az 1. példában leirt módon restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 23. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a aPl promoter közvetlenül az egyedi EcoRl hellyel azonos irányban helyezkedik el, amely ezt a plazmidot kellemes klónozó vektorrá teszi. A pLC34-ről úgy találtuk, hogy replikációs tulajdonságai a pOU51-ével azonosak. A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázatban mutatjuk be. Az E. coli C 600/pLC 34 törzset a 2946. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 22
