201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
35 MU 201116 B 36 fajta képződött telep sejtjeit McConkey laktóz indikátor lemezekre szélesztjük 30 °C hőmérsékleten, ahol a sejtek, amelyekbe pOU90 transzformálódott, vörös telepeket képeznek jelezve, hogy a plazmid megőrződött, mig a kontroll sejtek, amelyekbe a pOU82 transzformálódott, mind vörös, mind színtelen telepeket alkotnak, amely azt jelenti, hogy a szelekció nélküli periódus során a pOU82 elveszett a sejtek egy részéből. A köztes plazmidot, a pOU90-et ez után BamHI-val teljesen és Sau3A-val részlegesen elhasitjuk, hogy csökkentsük a plazmid méretét, igy hozva létre a cim szerinti plazmidot. Az E. coli CSH 50 transzformációja után a plazmid stabilitását olyan módon határozzuk meg, ahogyan azt már korábban leírtuk. A pOU91 molekulatömege 12,5.106 dalton és genotípusa a következő: cop A*, cop B*, rep A*, par*, immA*, bla*, lac*. A plazmidot az 1. példában leirt módon restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 14. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a pOU91-nek egyedi helye van mind az EcoRI, mind a BamHI számára, amely lehetővé teszi a plazmid alkalmazását klónozó vektorként. A pOU91-ről úgy találtuk, hogy replikációs tulajdonságai a pOU71-ével azonosak, de a pOU71-gyel ellentétben, ez a plazmid 30 °C hőmérsékleten teljesen stabil. A plazmid tulajdonságait az 5. táblázat mutatja be. Az E. coli CSH 50/pOU91 törzset 2483. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben. 12. példa pOUlOl (egy B típusú plazmid) megalkotása és jellemzése A 7. példában leírt plazmidot alkalmazva kiindulási anyagként, és a klóramfenikol-acetil-transzferázt (cat*) kódoló gént hordozó Sau3A beiktatásával a pOU75 BamHI helyére, megalkotjuk a cím szerinti plazmidot, amely klóramfenikol rezisztenciát visz át a gazdasejtbe. A plazmidot E. coli CSH 50-be transzformáljuk. A pOUlOl molekulatömege 4,7.106 dalton és genotípusa a következő: cop A*, cop B\ rep A*, apar, aaph A, immA*, bla*, cat*. A plazmidot az 1. példában leirtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 15. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a pOU 101-nek van egy egyedi helye EcoRI endonukleáz számára, amely lehetővé teszi a plazmid alkalmazását klónozó vektorként. Az EcoRI fragmens beiktatása inaktiválja a cat* gént, ez pedig lehetővé teszi az EcoRI hibridek kiválogatását. A kívánt plazmid jelenlétének demonstrálására a gazdasejtben, a sejt-tenyészeteket A-infekció-rezisztenciára és ampicillin-rezisztenciára vizsgáljuk a korábban már leirt módon. Ezen kívül a sejteket klóramfenikol rezisztenciára is megvizsgáljuk, tenyészeteket növesztve olyan lemezeken, amelyek 20 Mg/ml klóramfenikolt tartalmaznak. A pOU 101-ről úgy találtuk, hogy replikációs tulajdonságai azonosak a pOU71-ével. A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázatban mutatjuk be. Az E. coli CSH 50/pOU101 törzset 2757. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyüjteményben. 13. példa pOUllO megalkotása és jellemzése pOU80 plazmidból (amelyet a 10. példában jellemeztünk, lásd a pOU79 térképét is a 12. ábrában) a lac Z gén egy részét tartalmazó EcoRI - Cla I fragmenst kiiktatjuk, és helyettesítjük a deo promotort és a lac Z gén amino-terminális végét hordozó pVH1451 plazmid ból (Valentin-Hansen és munkatársai: EMBO Journal 1, 1982) származó EcoRI - Cla I fragmenssel. Az igy nyert plazmidot pOU83-mal jelöljük (lásd 16. ábra). A pOU83 plazmidot Bam HI-val és Bgl II-vel részlegesen emésztjük abból a célból, hogy a lac géneket, valamint a cl represszor gént és a aPr promotort hordozó DNS fragmenst kiiktassuk, összekötés (ligáció) és a CSH 50-be történő transzformálás után egy, a kívánt tulajdonságokkal rendelkező plazmidot izolálunk, amely egy szoros fúziót eredményez a deo promoter és a cop B gén között. A pOU110-zel jelzett plazmid molekulatömege 3,2-10® dalton és genotípusa a következő: cop A*, cop B*, rep A*, a par, bla*. A plazmidot az 1. példában leirtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 17. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy a plazmidnak egyedi restrikciós helye van mind az EcoRI, mind a Bam Hl restrikciós enzimek számára, ez alkalmassá teszi a plazmidot, hogy klónozó vektorként használják. Amikor E. coli S 0 929 (cyt R, lac, deo; rec A) törzset, amelybe pOU110-et transzformáltunk, növesztünk egy éjszakán át LB tápközegben glükóz nélkül, szabályozatlan plazmid replikáció jön létre 2.108 sejt/ml sejtsűrűség fölött. Az E. coli CSH 50/pOU110 törzset 2758. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben. 14. példa pOU130 megalkotása és jellemzése A pOU91 plazmidot Bam HI-val elhasítjuk és a Bam Hl helyet Bal 31 exonukleáz segítségével kiiktatjuk, így nyerjük a pOU92 plazmidot (ábrában nem mutatjuk be). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 20
