201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
33 HU 201116 B 34 indikélor lemezeken, amelyek 50 /ug/ml ampicillint tartalmaznak, 30 “C hőmérsékleten inkubélva. 20 órás, 30 °C hőmérsékleten történő inkubálás után a lemezeket egy rövid időtartamon át (1-2 óra) 42 °C hőmérsékleten inkubáljuk, és azokat a telepeket, amelyek eltolódnak Lac" (fehér)-ból Lac* (vörös) fenotipusba, tovább analizáljuk. A cim szerinti plazmidot azonosítjuk egy ilyen telepből. A pOU79 molekulatömege 8,8.10® dalton és genotípusa a következő: cop A*, cop B*, rep A*, apar, immA*, bla*, lac*. A plazmidot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 12. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a plazmádnak van egy egyedi helye a BamHI restrikciós endonukleáz száméra közvetlenül egyező irányban a beiktatott lac génekkel. Promotor-hordozó DNS fragmens beépítése erre a helyre a megfelelő orientációban a lac gének átírását eredményezi, így hozva létre az ilyen hibrid plazmidot hordozó sejtek Lac* fenotipusát 30 °C hőmérsékleten. A Lac* sejtek könnyen azonosíthatók McConkey laktóz indikátor lemezeken. A plazmidnak az EcoRI restrikciós endonukleáz számára is van egy egyedi helye, amely a lac Z gén egyik végén helyezkedik el. EcoRI fragmens beiktatása erre a helyre eltünteti a lac Z gén-termék, a £-galaktozidáz aktivitását, ez pedig Lac' fenotípust eredményez, amelyet könnyű észlelni, mint színtelen telepek képződését McConkey laktóz indikátor lemezeken, miután a hőmérsékletet 30 °C-ról 42 °C-ra változtattuk (lásd a korábbi leírást). A plazmid klónozó vektorként használható. A pOU79-ról úgy találtuk, hogy replikációs tulajdonságai a pOU71-ével azonosak. A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázatban mutatjuk be. Az E. coli CSH 50/pOU79 törzset a 2481. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyüjteményben. 10. példa pOU82 (egy B típusú plazmid) megalkotása és jellemzése A pOU79 plazmidot BamHI-el teljesen és Sál 1-el részlegesen elhasítjuk, és egy pSKS104-ből - amely olyan lac operont hordoz, amelyből a lac promotor ki van iktatva - eredő BamHI-Sall fragmenst és a lac Z gén első négy kodonját iktatjuk bele, igy alkotjuk meg a pOU80-at (ábrában nem mutatjuk be). A pOU80 Lac* plazmid és rendelkezik BamHI hellyel is, EcoRI hellyel is éppen a lac génekkel egyező irányban. Ezen kívül az az EcoRI hely, amely normálisan megtalálható a lac Z génben, hiányzik, mivel a pSKS104-ben levő lac gének a pMC1403-ból származnak (Casadaban és munkatársai: J. Bact. 143, 1980, 971). A cim szerinti plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy a pOU80 lac Z génjében (lásd a pOU79 térképét, 12. ábra) egy EcoRI-Clal fragmenst helyettesítünk egy deo promotort és a lac Z gén amino terminális végét hordozó pVH 1424-ből származó EcoRI-Clal fragmenssel. A helyettesítés a lac Z gén rekonstrukcióját eredményezi a deo promotor jelenléte következtében, az így nyert pOU82 hibrid plazmid Lac* fenotípust közvetít, amikor E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk. A pOU82 molekulatömege 8,1.10® dalton és genotípusa a következő: cop A*, cop B*, rep A*, apar, immA*, bla*, lac*. A plazmid végső fokon elvész a sejtekből 30 °C hőmérsékleten a par terület hiánya miatt, amely könnyen megfigyelhető nem szelektív McConkey laktóz indikátor lemezeken (lásd 11. példa). A plazmidot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 13. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a plazmidnak egyedi helyei vannak mind az EcoRI, mind a BamllI restrikciós endonukleázokhoz, amely lehetővé teszi, hogy a plazmidokat klónozó vektorként használjuk. A pOU82-ről úgy találtuk, hogy replikációs tulajdonságai a pOU71-ével azonosak. A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázatban mutatjuk be. Az E. coli CSH 50/pOU82-t 2482. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben. 11. példa pOU91 (egy B típusú plazmid) megalkotása és jellemzése Annak érdekében, hogy olyan plazmidot használjunk, amely stabil a megosztás tekintetében, a pOU82-t EcoRI-vel elhasitjuk, és egy RÍ származék, a pKN184 (Nordstrom és munkatársai: Plasmid 4, 1980, 322) vad-tipusú par területét magában foglaló EcoRI-A fragmenst iktatunk bele ezen a helyen, ezt a műveletet összekötés (ligáció) követi. Az így nyert plazmidot (pOU90, ábrában nem mutatjuk be) E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk, és a sejteket szelektíven növesztjük 50 ug/ml ampicillint tartalmazó lemezeken 30 °C hőmérsékleten. Kontrollként pOU82-t tartalmazó sejteket növesztünk hasonló módon, hogy biztosítsuk a plazmid jelenlétét mindkét indító telepben. Ezt követően mindkét telepből származó mintákat szélesztünk olyan lemezeken, amelyek semmiféle antibiotikumot nem tartalmaznak, és a sejteket nőni hagyjuk 25 sejtgeneráción át. Hogy a LacT fenotipus Btabil öröklődését kiválogassuk (screeneljük), mindkét 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 19
