201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
31 HU 201116 B 32 A-infekció elleni rezisztenciára és ampicillin rezisztenciára vizsgáljuk, valamint hőmérséklet-érzékeny növekedésre olyan módon, ahogyan ezt korábban leírtuk. A plazmidot vizsgáljuk még az EcoRi hely elvesztésére is az enzimmel emésztve. A pOU75-ről úgy találtuk, hogy replikációs tulajdonságai azonosak a pOU71-ével. A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázat mutatja be. Az E. coli CSH 50/pOU75 törzset 2473. letéti számmal helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben. 8. példa A gén-termék mennyiség-növelése pMC903 plazmidot (Casadaban és munkatársai: J. Bact. 143, 1980, 971) hasítjuk Bam Hl és Bgl II restrikciós enzimekkel, egy Bamíll-Bgl II fragmenset alakítva ki, amely lac géneket hordoz. pOU71 plazmidot BamHI-val hasítunk, és a fentebb nyert BamHl-Bgl 11 fragmenst beiktatjuk erre a helyre, amint 5 ezt a 11. ábra mutatja, ezt követi az összekötés (ligáció) T4 DNS ligázzal, Így állítva eló a pOU106 plazmidot, amelyet transzformálunk E. coli CSH 50 törzsbe. A sejteket McConkey laktóz indikátor lemezekre szélesztjük (lásd: 10 J. Miller: Experiments in Molecular genetics, Cold Spring Harbor, 1972), amely lemezek 50 jug/ml ampicillint tartalmaznak, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, hogy kiválaszthassuk a vörös telepeket (Lac*). A hómérsékle- 15 tét ez után 42 °C-ra változtatjuk, és a gén-termék (0-galaktozidáz) mennyiségi növekedését mérjük, amint ezt a 3. Táblázat bemutatja. A mérést a J. Miller (lásd fentebb idézett munka) által leírt módszer szerint hajt- 20 juk végre. 3. Táblázat A gén-termék mennyiség-növelése A találmány szerinti plazmid A korábban ismert plazmid (pKN410) Percek a 42 °C A gén-termék akkumulált Percek 42 °C A gén-termék akkumulált hőmérsékletre viszonylagos fajlagos hőmérsékletre viszonylagos fajlagos átállítás után aktivitása1 2 átállítás után aktivitása3 0 10 0 10 10 21 25 34 55 62 60 20 83 107 90 47 xEnzim aktivitás/teljes fehérje-mennyiség, vagyis a ű-galaktozidás növekedése/sejt 2pOU106 által közvetített /3-galaktozidáz 3pKN410 által közvetített 0-laktamáz (Uhlin és munkatársai: Gene, 6, 1979, 11. Táblázat, 100 oldal) A táblázatból kitűnik, hogy a gén-termék mennyiségnövelési szintje összehasonlítható azzal, amelyet mások .megvaduló' vektorokkal nyertek (pl. Uhlin és munkatársai: Gene 6, 1979, 91-106). A promotor, amelyből a fl-gáláktozidáz gén ki van fejezve, a cl promotor és/vagy a tetraciklin-promotor, amely a pBR322-böl származó DNS fragmensen helyezkedik el, amely, bár viszonylag gyenge, nem mellőzhető, mint befolyásoló tényező és amely ugyanabban az irányban ir át, mint a cl promotor. A pOU106-ot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 11. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a plazmidnak van egy egyedi helye a BamHI restrikciós endonukleáz számára közvetlenül egyező irányban a beiktatott lac génekkel, amelyek a plazmidot alkalmassá teszik klónozó vektornak. 45 A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázat mutatja be. Az E. coli CSH 50/pOU106-ot 2474. letéti számmal helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben. 50 9. példa pOU79 (egy B-tipusú plazmid) megalko- 55 tása és jellemzése A pOU71 plazmidot BamHI-val teljesen és Pst I-el részlegesen elhasítjuk, és összekötjük egy, a pMC871 plazmidból (Casadaban és munkatársai: J. Bact. 143, 1980, 971) - aroe- 60 lyet korábban BamHI-val és Pstl-el teljesen elhasítottunk - származó, lac operont hordozó DNS fragmenssel. Az összekötő (ligációs) keveréket E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk, ampicillin 65 rezisztenciára szelektálva McConkey laktóz 18
