201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
29 HU 201116 B 30 teket továbbra ampicillin-rezisztenciára Is megvizsgáljuk a fentebb leirt módon. A plazmid molekulatömegét agaróz-gél elektroforézissel határozzuk meg. A hőmérséklet-érzékeny növekedés vizsgálatát a fentebb leirt módszerrel hajtjuk végre. A pOU57 replikációs tulajdonságait azonosnak találtuk a pOU53 replikációs tulajdonságaival. Ennek a plazmidnak a tulajdonságait az 5. Táblázat mutatja be. Az E. coli CSH 50/pOU57 törzset 2470. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyüjteményben. 5. példa pOU71 (egy B-tipusú plazmid) megalkotása és jellemzése A 4. példában leírt plazmidot alkalmazva kiindulási anyagként és beiktatva egy pKN1562-ból eredő Bgl II fragmenst, amely tartalmazza a pOU57 Bgl II helyén levő cop B gén egy részét, megalkotjuk a cim szerinti plazmidot, amely hordozza mind a cI-aPb represszor-proniotor rendszert, mind az Rl-tipusú plazmidok cop B inhibitorát kódoló vad-típusú gént. A plazmidot E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk. A pOU71 molekulatömege 4,3.10® dalton és genotípusa a következő: cop A*, cop B*, rep A*, apar, aaph A, immA*, bla*. A plazmidot az 1. példában leírt módszer szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 8. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a pOU71-nek az egyedi restrikciós helyei ugyanazok, mint a pOU57-é. Hogy a kívánt plazmid jelenlétét a gazdasejtben demonstráljuk, a sejt-tenyészeteket megvizsgáljuk A-infekcióra való rezisztenciára és ampicillin rezisztenciára a fentebb leirt módon. A plazmidokat azután cop B gén jelenléte alapján kiválogatjuk (screeneljük) a korábban .Kiválogatás (screenelés) cop B*-re című szakaszban leirt módszer szerint. A hömérsékletérzékeny növekedés vizsgálatát a fentebb leírt módon hajtjuk végre. Végül a plazmid-kópiák számát 30 °C hőmérsékleten meghatározzuk radioaktív jelzés és gradiens-centrifugálás segítségével. Amikor a plazmid DNS-tartalmat mérjük az 1. példában leírt módon, a sejtekről úgy találjuk, hogy 3-5 plazmidkópiát tartalmaznak 30 °C hőmérsékleten, és több, mint 1000 plazmid-kópiát 42 °C hőmérsékleten. 30 “C hőmérsékleten a plazmid lX/generáció gyakorisággal vész el. A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázat mutatja be. Az E. coli CSH 50/pOU71 törzset 2471. letéti számmal helyeztük el a DSM tórzsgyűjteményben. ü. példa pOU73 (egy C típusú plazmid) megalkotása és jellemzése A 4. példában leírt plazmidot alkalmazva kiindulási anyagként, és a pOU57 EcoRI helyébe cop B gént hordozó, pOU16-ból származó EcoRI fraginens beiktatásával a cim szerinti plazmidot megalkotjuk, amely plazmid rendelkezik a cop B inhibitor génjével, valamint a cI-aPr represszor-promotor rendszerrel. A plazmidot E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk. A pOU73 molekulatömege 4,4.10® dalton és genotípusa a következő: cop A*, cop B*, rep A’, apar, aaph A, immA*, bla*. A plazmidot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 9. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a cop B gén a plazmidnak egy olyan helyén van beiktatva, ahol az természetes módon nem szokott elhelyezkedni. Az tűnik ki továbbá, hogy a plazmidnak van egy egyedi helye a Bam Hl restrikciós endonukleázhoz úgy, hogy ezt lehet klónozó vektorként is használni. Ugyanazokat a kiválogatási módszereket használjuk, mint amelyeket a pOU71-nél alkalmaztunk. Amikor a plazmid DNS tartalmat mérjük az 1. példában leirt módon, a sejtekről úgy találjuk, hogy 0,5-1 plazmidkópiát tartalmaznak 30 °C hőmérsékleten és több, mint 1000 plazmid-kópiát 42 °C hőmérsékleten. 30 °C hőmérsékleten a plazmid több, mint 5%/generáció gyakorisággal vész el. A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázat mutatja be. Az E. coli CSH 50/pOU73 törzset 2472. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyűjteményben. 7. példa pOU75 (egy B típusú plazmid) megalkotása és jellemzése Az 5. példában leírt plazmidot alkalmazva kiindulási anyagként és a pOU71 Hind III-al történő részleges emésztésével a cim szerinti plazmidot alkotjuk meg, amelyből az EcoRI hely ki van iktatva. A plazmidot E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk. A pOU75 molekulatömege 4,2.10® dalton és genotípusa a következő: cop A', cop B*, rep A*, apar, aaph A, immA*, bla*. A plazmidot az 1. példában leírt módszer szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 10. ábra). A restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 10. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a Hind III fragmens kiiktatása a pOU71 EcoRI helyének eltávolítását eredményezi. Hogy demonstráljuk a kívánt plazmid jelenlétét a gazdasejtben, a sejt-tenyészetet 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 17
