201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
27 HU 201116 B 28 2. példa pOU53 megalkotása és jellemzése Az 1. példában leirt plazinidoL használva kiindulási anyagként, és ezt a pOU51-et részlegesen emésztve Hind III-mal hozzuk létre a cím szerinti plazmidot, amelyből a kanamicin rezisztenciát hordozó gén ki van iktatva, de amely megőrzi a a immunitást hordozó gént. A törzset E. coli CHS 50 törzsbe transzformáljuk. A nyert pOU53 molekulatömege 3,2.103 * * 6 dalton és genotípusa a következő: cop A*, acop B, rep A*, apar, immA*, Aaph A. A plazmidot restrikciós enzimekkel feltérképezzük az 1. példában leírtak szerint (lásd 5. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy a pOU53-nak van egy egyedi helye EcoRl restrikciós endonukleázhoz, amely lehetővé teszi a plazmidnak mint klónozó vektornak a használatát. Hogy a kívánt plazmid jelenlétét a gazdasejtben demonstráljuk, sejt-tenyészeteket növesztünk Ab2 fág-részecskéket tartalmazó lemezeken, amint ezt korábban leírtuk a a-infekcióra való rezisztencia vizsgálatához. A sejteket tovább vizsgáljuk kanamicin-érzékenységre replika-lemez telep-átviteli módszerrel olyan lemezeken, amelyek 50 pg/ml Km-t is tartalmaznak. Hogy megvizsgáljuk a hőmérséklet-érzékeny növekedést, a sejteket 42 °C hőmérsékleten lemezekre szélesztjük, és az 1. példában leirt módon növesztjük. Amikor a plazmid DNS tartalmat mérjük az 1. példában leírt módszerrel, a sejtekről úgy találjuk, hogy 20-40 plazmid-kópiát tartalmaznak 30 °C hőmérsékleten és több, mint 1000 plazmid-kópiát 42 °C hőmérsékleten. Plazraid-elvesztés nem volt. Ennek a plazmidnak a tulajdonságait az 5. táblázat mutatja be. Az E. coli CSH 50/pOU53 törzset a DSM törzsgyüjteményben 2468 letéti számon helyeztük el. 3. példa pOU56 megalkotása és jellemzése A transzponálásért és az ampicillin rezisztenciáért (/3-laktamáz) (Nordstrom, Molin és Aagaard-Hansen, Plasmid 4, 1980, 215-27) felelős géneket magában foglaló a: : Tn 3-ból származó Tn3 transzpozon in vivo beiktatásával pOU53-ba alkotjuk meg a cím szerinti plazmidot. A plazmid DNS-t a ATn 3 fágot a kromoszómákban hordozó és a pOU53 plazmidot is hordozó törzsből izoláljuk. A plazmid DNS-t E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk, ampicillin rezisztenciára és a immunitásra szelektálva. A pOU56 molekulatömege 6,5.10® dalton, és genotípusa a következő: cop A*, acop B, rep A*, aaph A, immA*, bla* (: : Tn3). A plazmidot az 1. példában leírt módszer szerint restrikciós enzimekkel feltérképezzük (lásd 6. ábra). A restrikciós térképek azt mutatják, hol van a Tn3 transzpozon beiktatva a pOU56-ba, és azt is megmutatják, hogy a plazmidnak van egy egyedi helye mind az EcoRl, mind a Bam Hl restrikciós endonukleázokhoz. Miközben a plazmid használható kiindulási anyagként a pOU57 készítéséhez (lásd később a 4. példát), nem ajánlható ugyanez klónozó vektorként, mivel a transzponáló gén jelenléte következtében az antibiotikum-rezisztenciát át lehet vinni más baktériumba. A kívánt plazmid jelenlétének demonstrálására a gazdasejtben, sejt-tenyészeteket növesztünk Ab2 fág részecskéket tartalmazó lemezeken a fentebb leirt módon a a infekcióra való rezisztencia vizsgálatához. A sejteket továbbá ampicillin rezisztenciára is megvizsgáljuk 50 jug/ml ampicillint tartalmazó lemezeken. A hőmérséklet-érzékeny növekedés vizsgálatát a fentebb leirt módszerrel hajtjuk végre. A pOU56 replikációs tulajdonságait azonosnak találtuk a pOU53 replikációs tulajdonságaival. Az E. coli CSH 50/pOU56 törzset 2469. letéti számon helyeztük el a DSM törzsgyüjteményben. 4. példa pOU57 (egy A típusú plazmid) megalkotása és jellemzése Abból a célból, hogy a Tn3 transzponálásénak lehetőségét megszüntessük pOU56 plazmidból, amely a teljes transzpozon hordozásának következménye lehet, a plazmidot a Bam Hl és EcoRl helyeknél elhasítjuk, hogy kiiktassuk a transzponáló gént, míg a /3-laktamázt kódoló gén megmarad. Abból a célból, hogy hatást gyakoroljunk a .ragadós' vég összeforrasztására (annealing), egy kis, pBR322-ból származó Bam Hl - EcoRi fragmenst iktatunk be, igy alkotjuk meg a pOU57 plazmidot. A plazmidot E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk. A pOU57 molekulatömege 4,2.10® dalton, és genotípusa a következő: cop A*, Acop B, rep A*, Apar, Aaph A, immA*, bla* (ATn3). A plazmidot restrikciós enzimekkel feltérképezzük az 1. példában leirt módszerrel (lásd 7. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a pOU57-nek egyedi helyei vannak mind a Bam Hl, mind az EcoRl restrikciós endonukleázokhoz, amely ezeket alkalmassá teszi klónozó vektorként történő felhasználásra. A kívánt plazmid jelenlétének demonstrálására a gazdasejtben, sejt-tenyészeteket növesztünk Ab2 fág részecskéket tartalmazó lemezeken a fentebb leírt módon a A infekcióra való rezisztencia vizsgálatához. A sej-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 16
