201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
25 HU 201116 B 26 . Szülő plazmidok A pKN1562 plazmid az RÍ plazmid származéka, minden lényeges részben a Molin és munkatársai által leírt módszerrel konstruálva (.Clustering of Genes Involved in Replication, Copy Number Control, Incompatibility, and Stable Maintenance on the Resistance Plasmid Rldrd-19") Az Rldrd-19 rezisztencia-plazraid replikációjában, kópiaszám szabályozásában, összeférhetetlenségében és stabil fenntartáséban érdekelt gének csoportosítása), J. Bact. 138, 1979, 70-79. oldal), azzal a néhány módosítással, amelyet a későbbi kutatás hozzáadott. A pKN1562 molekulatömege 6,9.10® dalton és genotípusa a következő: cop A*, cop B1 * * 4 * * *, rep A4, aph A4, apar (lásd 3. ábra). Ez kanamicin-rezisztenciát hordoz. A plazmid a vad-típusú plazmid replikációs tulajdonságaival bir, kópiaszáma 3-5/gyorsan növő sejt és 1%/generóció gyakorisággal vész el a par gén (a megosztás génje) hiánya miatt. A pKN1562 Bgl II-vel végzett hasításával a cop B gén egy részének kiiktatása érdekében és a vágott végek összekötésével egy másik plazmidot, a pJL20-at alkotjuk meg. Ennek a plazmidnak a molekulatömege 6,7.10® dalton és genotípusa a következő: cop A4, acop B, rep A4, aph A4, apar. A plazmid kópiaszáma 25-40/gyorsan növő sejt, és nincs vezteség a plazmidból. Ez a plazmid szintén közvetít kanamicin-rezisztenciát. Plazmid-jelölés Meg kell jegyezni, hogy a pJEL...-lel jelölt plazmidokat, amelyek az alap-bejelentés példáiban és rajzaiban szerepeltek, átneveztük a jelen bejelentésben pOU...-ra. 1. példa pOU51 megalkotása és jellemzése A pJL20 plazmidból és EDa4 fágból DNS-t készítünk standard módszerek szerint. A plazmid- és a fág DNS-t összekeverjük mindkettőre nézve 20 ug/ml végső koncentrációban és 100 ul végső térfogatban, 30 percig emésztjük Bgl II-vel, 70 °C hőmérsékleten 10 percen ót hővel inaktiváljuk, majd T4 ligázzal összekötjük 15 °C hőmérsékleten egy éjszakán ót. Az összekötő (li— gációs) keverék alikvotjait E. coli CSH 50 törzsbe transzformáljuk. A transzformánsokat 50 Mg/ml kanamicint tartalmazó lemezeken szelektáljuk, amelyre kb. 109 Ab2 szuszpenziót szélesztettünk. A lemezeket 20 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A túlélő telepeket újra izoláljuk és Ab2 rezisztenciára vizsgáljuk 30 °C hőmérsékleten történő kereszt-szélesztéssel, 42 °C hőmérsékleten történő növekedésre Km lemezekre 42 °C hőmérsékleten történő szélesztéssel, és a plazmid molekulatömegére a plazmid DNS kipreparálásával és agaróz gélen történő elemzésével. Ilyen módon egy olyan plazmidot találtunk, amely Km-re és A-fertőzésre való rezisztenciát közvetít, a gazdasejtnek hőmérséklet-érzékenységet nyújt a növekedéshez, és fág DNS beiktatással rendelkezik pJL20- -ban, amely kb. 1,6.10® daltonnak felel meg. A plazmid teljes molekulatömege 8,4.10® dalton. Ezeket a tulajdonságokat mind a plazmid hordozza, mivel az új E. coli befogadó törzs az összes plazmid-eredetü fenotipusos tulajdonságot csak akkor szerezte meg, amikor transzformáltuk pOU51 DNS-el. A pOU51-ből a DNS-t kipreparáljuk, és a plazmidot restrikciós enzimekkel feltérképezzük a plazmid DNS tisztításával, restrikciós enzimmel vagy enzimekkel történő hasítással és a nyert fragmens elemzésével agaróz-gél elektroforézis segítségével (lásd 4. ábra). Ezen a módon a beiktatott 1,6.10® dalton méretű fragmenst mint aPe proraotort és cl represszor gént (amely a A immunitásért felelős 30 °C hőmérsékleten) hordozó A fágból eredő Bgl II fragmenst azonosítjuk, és a beiktatott fragmens orientációját a 4. ábrában bemutatott módon azonosítjuk. A restrikciós térképből továbbá kiderül, hogy a pOU51-nek van egy egyedi helye EcoRI restrikciós endonukleázhoz, amely lehetővé teszi a plazmid alkalmazását klónozó vektorként. A plazmidnak a sejtek növekedésére gyakorolt hatását 30 °C hőmérsékleten egy tenyészetet egy tápközegben növesztve vizsgáljuk meg. Abban az időszakban, amikor a növekedés exponenciális, a hőmérsékletet 42 °C-ra változtatjuk és a sejt növekedését követjük (spektrofotometriásán meghatározva). 1,5-2 órán belül a tenyészetet 42 °C hőmérsékleten megszűnik növekedni. A plazmid DNS-tartalmat azzal a módszerrel mérjük, amelyet az Anyagok és módszerek fejezetben leirtunk, 10 ml olyan A4B minimál tápközegben növő tenyészetből, amelyet kiegészítünk 0,2% glükózzal és 1% kazamino-savval. Egyik 10 ml-es tenyészetet 50 pCi 3H timidinnel jelezzük 30 °C hőmérsékleten, a másikhoz az izotópot éppen az után adjuk, miután a hőmérsékletet 42 °C-ra változtatjuk, egészen addig, amíg a sejt növekedése meg nem szűnik. A relativ plazmid DNS tartalom 2% 30 °C hőmérsékleten, amely 25-40 plazmid-kópiának felel meg sejtenként. 42 °C hőmérsékleten a relatív tartalom több, mint 50%, amely több, mint 1000 plazmid-kópiának felel meg sejtenként. A plazmid tulajdonságait az 5. Táblázat mutatja be. Az E. coli CSH 50/pOU51 törzset a Német Mikroorganizmusok Gyűjteményében (Deutsche Sammlunk von Mikroorganismen, Griesbach-stasse 8, D-3400, Göttingen, Német Szövetségi Köztársaság), (a továbbiakban ezt DSM-el rövidítjük), helyeztük el 2467 letéti számon. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
