201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1972). Többféle plazmidot (lásd 1. Táblázat) és bakteriofágot (lásd 2. Táblázat) használtunk. Az alkalmazott technikák a mikrobiológiai genetika területén alkalmazott standard technikák (J. Miller: Experiments in Molecular Genetics) Kísérletek a molekuláris genetikában), Cold Spring Harbor, New York, 1972) és geneLikai manipulációk (Davis, Botstein és Roth: A Manual for Genetic Engineering (A gén-technikák kézikönyve); Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1980). Az összes sejtet LB tápközegben (Bertoni: J. Bact. 62, 1951, 293) vagy A*B minimál tápközegben (Clark és Maal^e: J. Mol. Biol. 23, 1967, 99) növesztettük, és az alkalmazott lemezek LB tápközeget és 1,5% agart tartalmazó LA lemezek voltak. A plazmid DNS preparálását és analízisét boyant festék sűrűség-gradiens centrifugálással végeztük a Stougaard és Molin által leirt (Anal. Biochem. 118, 1981, 191) módszer szerint. A DNS és a lizátumok preparátumainak jelzése a plazmid-tartalom meghatározásához Molin és munkatársai szerint (J. Bact. 138, 1979, 70) történt. A plazmid DNS relativ mennyiségét mint a plazmid-kötésben jelenlevő jelzett timidin mennyiségét mértük, a kromoszomális kötésben levő mennyiséghez viszonyítva a gradiensben. A példákban alkalmazott restrikciós endonukleázokat a gyártó által szolgáltatott előírásokkal összhangban használtuk. A részleges hasítást az enzimek tízszeres hígításával hajtottuk végre. Ezen kívül a következő kiválogatási (screenelési) módszereket alkalmaztuk: 1. ) Kiválogatás A immunitásra (immA*) Az összes leírt példában a cls57 mutáns alléit használjuk. Az ezt a gént hordozó plazraidoktól az E. coli gazdasejt ellenállóvá válik a lizáló A fágok fertőzésére 30 °C hőmérsékleten. Hogy kiválasszuk a rezisztens sejteket, több, mint 106 Ab2 fág részecskét adunk a lemezhez, mielőtt a baktériumot elszélesztjük, A túlélő telepeket tovább vizsgáljuk plazmid-tartalomra. 2. ) Kiválogatás cop B*-re Genetikai fúziót hajtunk végre a rep A promotor és olyan lac operon között, amelyből a lac promotor ki van iktatva, és a fúziós terméket egy pl5 plazmidba iktatjuk be (pGA46). A létrejött hibrid-plazmidok egyike, a pJL217 felelős a Lac* fenotípusért, amikor egy a lac E. coli gazdasejt befogadja ezt. A Lac* fenotípus könnyen kimutatható McConkey laktóz indikátor lemezeken (vörös telepek). A cop B* gének jelenléte a pJL217- -et befogadó sejtekben egy Lac- fenotipust eredményez, amely fehér telepekként jelenik meg az indikátor lemezeken. így a cop B* hibridek könnyen jelezhetók Lac* telepekként, amikor a plazmid DNS-t olyan E. coli a 23 HU 16 B 24 lac sejtekbe transzformáljuk, amelyek befogadják a pJL217 plazmidot. 1. TÁBLÁZAT Az alkalmazott plazmidok Plazmid Forrás PKN1562 . S. Molin és munkatársai: J. Bact. 138, 1979, 70-79. oldal pBR322 F. Bolivar és munkatársai: Gene 2, 1977, 95. oldal pJL217 Egy rep A promotort hordozó pKN1562-böl származó Sau 3 A fragmens beiktatásával készült a pJL207 Bgl II helyére, lac promotor nélküli lac gént hordozó hibrid plazmid pOU16 Light és Molin: Mol. Gen. Genet. 184, 1981, 57. oldal pGA46 An és Friesen: J. Bact. 140, 1979, 400-407. oldal pMC903 Casadaban és munkatársai: J. Bact. 143, 1980, 971. oldal pVH1424 P. Valentin-Hansen által készítve, a pVH17 plazmidból (Valentin-Hansen és munkatársai, EMBO J. 1982, 317) származó deo promotort hordozó Sau 3 A fragmens beiktatásával a pMC1403 plazmid (Casadaban és munkatársai, fentebb idézett munka) Bam Hl helyére. pSKS104 M. Casadaban által konstruálva egy lac promotort és egy pM13mp 7-ből (Messing és munkatársai: Nucleic Acids Res. 9, 1981, 309) származó transzláció-beindító (ini— ciációs) helyet tartalmazó Pvu II fragmens beiktatásával a pMC 1403 Sma I helyére majd ezt követően a lac Z szegmensek közötti homológ rekombinációval pKN184 Nordstrom és munkatársai: Plazmid 4, 1980, 322 pJL3 Molin és munkatársai: Mol. gén. Genet. 181, 1981, 123-130. pVH1451 Valentin-Hansen és munkatársai: fentebb idézett közlemény pBEU14 Uhlin és Clark: J. Bact. 148, 1981, 386-90 PMC1403 Casadaban és munkatársai: J. Bact. 143, 1980, 971 2. TÁBLÁZAT Az alkalmazott bakteriofágok Fág Forrás EDa4 Dempsey és Willets: J. Bact. 126, 1976, 166. oldal EDATn3 Nordstrom, Molin, Aagaard-Hansen: Plasmid, 4, 1980, 215-27. oldal 2011 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
