201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
21 HU 201116 B 22 növesztése a plazmid gén-termékének megnövekedett mennyiségű képződésével együtt (amely terméket azután folyamatosan vagy szakaszosan ki lehet nyerni a tenyészetből ismert módon). Egy másik módszer szerint a mikroorganizmust szaporíthatjuk egészen egy termelő szintű tenyészetig olyan hőmérsékleten, amelynél a plazmid kópiaszám konstans, ez utón a hőmérsékletet felemeljük olyan vagy közel olyan hőmérsékletre, amelynél a plazmid kópiaszám jelentősen növekedett vagy szabályozatlan, és ezt a hőmérsékletet fenntartjuk olyan időtartamon keresztül, amely alkalmas a plazmid lényeges mennyiségi növelésének eléréséhez, de megfelelően rövid a mikrobiológiai tenyészet bármiféle károsodásának elkerüléséhez, ez után a hőmérsékletet még egyszer visszaigazítjuk olyan hőmérsékletre amely egy kis, konstans plazmid kópiaszámot biztosít, és a termelő tenyésztést ezen az utóbbi hőmérsékleten folytatjuk, lassú csökkenést idézve elő a plazmid kópiaszámban egészen addig, amíg az el nem éri a kiindulási szintjét. Ez a tenyésztési módszer különösen fontos, amikor a plazmidba beiktatott idegen gén egy olyan organizmusból származik, amely nem életképes kb. 30 °C fölötti hőmérsékleten úgy, hogy az ilyen gén termékei magasabb hőmérsékleten denaturélódhatnak. Sót, a gén-termékek hozama általában nagyobb, amikor ezt a tenyésztési módszert alkalmazzuk, (lásd a 16. példát, hasonlítsd össze Uhlin és munkatársainak közleményével /Gene 6, 1979, 91-106/). A hőmérséklet, amelynél a plazmid kópiaszáma lényegesen megnövekedett vagy szabályozatlan, magasabb lehet, mint az a hőmérséklet, amelynél a plazmid konstans, kis kópiaszámmal rendelkezik. Ez a nagyobb hőmérséklet lehet pl. a 36-42 °C tartományban. Az ábrák leírása A rajzokra teszünk itt utalásokat, amelyekben az 1. ábra a vad típusú RÍ plazmid replikációs területének sematikus vázlata, a 2. ábra a következő ábrákban használt jelzésekhez szolgáló kulcs, a 3~14. ábrák mutatják be a példákban leirt plazmidok restrikciós térképeit. Az 1. ábrában az RÍ alap-replikonjának sematikus képét mutatjuk be, amelyben a vonalkázott területek az átültetett területeket, míg az üres területek az átiratokat (transzkriptumokat), és a szaggatott vonalak a lehetséges transzkriptumokat jelzik. A körön belül a hajtü-hurok felnagyított képe a Cop-A-RNS nagymértékű szekunder szerkezetének illusztrálását kívánja megvalósítani. Az Őri a replikáció beindítását jelzi. A vízszintesen elhelyezett nyilak az átírás irányát jelzik. A 2. ábra a további ábrákban használt jelzéseket mutatja: az A jelenti az Rl-típusú plazmidokból származó DNS-t; B jelenti a a bakteriofágból (EDa4) származó DNS-t; C jelenti a (EDATn 3-ból származó) Tn 3 transzpozont; D jelenti a pBR 322 plazmidból származó DNS-t; E jelenti a pMC 871 plazmidból származó DNS-t; F jelenti a pVH 1424 plazmidból származó DNS-t; G jelenti a pSKS 104 plazmidból származó RNS-t; H jelzi a strukturgéneket és fontos helyeket; I egy promotort jelent az átírás irányának jelzésével; és J a plazmidok dimenzió-skáláját jelenti. Az üres terület a pBEU 14-ból származó DNS-t jelenti. A 3-14. ábrákban a példákban leírt plazmidok lineáris restrikciós térképeit mutatjuk be, amelyekben az ábrázolt RÍ típusú plazmidok genotípusai a vízszintes vonal felett vannak jelezve. így a cop B egy olyan gént képvisel, amely egy olyan polipeptidet kódol, amely represszálja a rep A promotorból származó átírást a cop B és a cop A gének között; a cop A egy olyan gént képvisel, amely olyan RNS molekulát kódol, amely gátolja a Rep A-mRNS transzlációt, a rep A olyan gént képvisel, amely egy olyan fehérjét kódol, amely az RÍ fehérje replikációjéhoz szükséges; az őri a replikáció vegetatív eredőjét (origin) jelenti; aph A egy olyan gént képvisel, amely a kanamicinre történő rezisztenciát kódolja; bla egy olyan gént képvisel, amely az ampicillinre történő rezisztenciát kódolja; lac A, lac Y és lac Z a beiktatott lac operont képviselik, amelyek közül lac A kódolja a transz-acetilázt, a lac Y kódolja a permeázt és lac Z kódolja a ß-galaktozidázt; cUst egy olyan gént képvisel, amely a aPk promotor hőmérséklet-érzékeny represszort kódolja; tnpR és tnpA olyan géneket képviselnek, amelyek Tn3 transzponáló funkciókat kódolnak; par azt a területet képviseli, amely felelős a plazmid megosztásáért; rec A egy olyan gént képvisel, amely egy rekombinációs fehérjét kódol; és Prec A képviseli a rec A promotort. A vízszintes vonal alatt a restrikciós enzimek helyeit mutatjuk be, amelyekben P jelenti a Pst 1-et; Bz jelenti Bgl II—t; Sí jelenti Sal I-et; E jelenti EcoRl-et, Hs jelenti Hind III— -of, Bi jelenti Bam HI-et; S jelenti Sma I-et; BzBi egy fúziót jelent egy Bgl II hely és egy Bam Hl hely között; és C jelenti Cla I-et. A 11. ábrában az ábrázolt plazmidok ugyanolyan méretarányban vannak lerajzolva, mint a többi ábrában levő plazmidok, és a zárójelben levő beiktatás képviseli a beiktatott lac géneket. Anyagok és módszerek Az alkalmazott Escherichia coli K 12 törzs CSH 50 volt (a pro-lac, rpsL; lásd: J. Miller: Experiments in Molecular Genetics /Kísérletek a molekuláris genetikában/, Cold 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
