201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
11 12 HU 201115 B kiválaszthatók a transzformált sejtek az előre szelektált fúziós termékek között, ad 3) Mivel a sejtfal nélküli élesztösejtek nem osztódnak, a sejtfalat regenerálni kell. A regenerálást kényelmesen végrehajthatjuk a 5 szferoplasztokat agarba ágyazva. Például olvasztott agart (körülbelül 50 °C) keverünk el a szferoplasztokkal. Az oldaLot az élesztő növekedési hőmérsékletére hűtve (körülbelül 30 ~°C) szilárd réteget kapunk. Ez az agarré- 10 teg megakadályozza, hogy a szferoplasztoktól gyorsan eldiffundáljanak és ezáltal elvesszenek a fontos makromolekulák, így megkönynyíti a sejtfal regenerálódást. A sejtfal-regenerálódásét azonban elérhetjük úgy is (jólle- 15 hét alacsonyabb hatékonysággal), ha a szferoplasztokat előre elkészített agarrétegre szélesztjük. A regeneráló agart előnyösen úgy készítjük el, hogy a transzformált sejtek rege- 20 nerálását és szelekcióját is lehetővé tegye egyidejűleg. Mivel szelektív markerekként általában az aminosavak bioszintézisében résztvevő enzimeket kódoló géneket használunk (lásd 1. fejezet), a regenerálást elönyö- 25 sen élesztő minimális agartáptalajon végezzük. Ha nagyon magas hatékonyságú regenerálásra van szükség, előnyös a következő kétlépéses eljárás: 1) a sejtfal regenerálása gazdag, komplett táptalajban és 2) a transz- 30 formált sejtek szelekciója a sejtréteg szelektív agarlemezekre való replikázásával. Ha a hibrid-vektor nem tartalmaz marker gént, a transzformált sejteket más módszerek felhasználásával is azonosítani lehet. 35 Ilyen módszer például az in situ hibridizálás a hibrid-vektor egyes szakaszával homológ, jelzett DNS fragmenttel [például Hinnen és munkatársai módszere szerint, lásd (12)], in situ immunassay, ha a bevezetett gén terme- 40 kével szembeni antitest elérhető, vagy más, a transzformáló plazmid(ok) által kódolt gének termékeit mérő módszerek. Más módszer szerint, az élesztőt ko-transzformálhatjuk egy, a találmány szerinti 45 hibrid-vektorral, valamint egy második, élesztő genetikai markert tartalmazó vektorral. Ha a két különböző vektornak van közös DNS szakasza (ezek lehetnek a vektorokban levő bakteriális eredetű szakaszok), rekombi- 50 náció játszódik le, mely egy fuzionált, szelektálható hibrid-molekulához vezet. Az élesztőt ko-transzformálhatjuk még olyan lineáris DNS szakasszal, mely a két végén az élesztő kromoszómájával homológ sza- 55 kaszokhoz kapcsolódó TPA gént tartalmaz, valamint egy élesztő szelektív markert tartalmazó vektorral. A ko-transzformáció lehetővé teszi az olyan DNS-t felvett sejtek dúsítását, melyekre nem lehet közvetlenül sze- 50 lektálni. Mivel a kompetens sejtek bármilyen típusú DNS-t felvesznek, a szelektív vektorral transzformált sejtek nagy százaléka tartalmaz bármely, még hozzáadott DNS-t (azaz a TPA gént a homológ 3’, 5' szakaszokkal 65 8 tartalmazó DNS szakaszt (50). Elegendő hoszszú homológ szakaszok segítségével (például körülbelül 20-100 dezoxinukleotid hosszúságú) a TPA gén stabilan beépül a gazda-kromoszómába. Kiemelve az az eset, ha a lineáris DNS szakasz a TPA gént szabályozó PH05 promoter! és a PH05 terminátor szakaszt tartalmazza. Ez a konstrukció vezet a TPA génnek a PH05 gén helyére való stabil beépüléséhez az élesztő II. kromoszómába. A jelen találmány tárgya továbbá egy élesztópromotert, az említett promoterrel kontrollált szöveti plazminogén aktivátor gént és egy élesztő géntranszkripciós terminációs jelét tartalmazó DNS-szakaszt tartalmazó lineáris DNS-darab. A kapott, a találmány szerinti hibrid plazmidokat tartalmazó élesztötörzsek TPA-termelő képességét a szakterületen ismert módszerekkel, mutációval és szelekcióval növelhetjük. A mutagén kezelést végezhetjük például ultraibolya fénnyel való besugárzással, vagy megfelelő kémiai reagensekkel. A találmány tárgyai továbbá azok az élesztő-gazdasejtek, melyeket élesztöpromotert és az említett promoterrel kontrollált TPA-t kódoló szakaszt tartalmazó hibrid-vektorokkal transzformált élesztó-gazdsejtek közül szelektálunk, valamint azok az élesztőgazdasejtek, melyekben a szöveti plazminogén aktivátor stabilan integrálódott egy élesztökromoszómába, és a gén egy élesztőpromoter kontrollja alatt áll, valamint ezek mutánsai. 3. A transzformált élesztösejtek növesztése és a keletkezett TPA izolálása A jelen találmány szerint a TPA gén élesztőben való kifejeződésének elsődleges terméke a TPA egyláncú prekurzor fehérje (.pro-TPA.). Ha azonban proteázok vannak jelen akár az élesztő-gazdasejtben, a periplazmatikus térben vagy a tenyészlében, az elsődlegesen keletkezett pro-TPA, legalábbis részlegesen kétláncú TPA-vá alakulhat. A ténylegesen izolált termék ennélfogva lehet TPA, pro-TPA vagy ezek keveréke. Ha a TPA-t kódoló szakaszt a jelen találmány szerinti hibrid-vektorban szignálszakasz előzi meg, a kiválasztás összekapcsolódik legalább részlegesen, glikolizeléssel. A kapott termék tehát tartalmazhat glikozilezett és glikozilezetlen fehérjéket. A találmány tárgya továbbá eljárás TPA pro-TPA vagy ezek olyan keverékeinek előállítására, melyekben a TPA és a pro-TPA glikozilezett vagy glikozilezetlen formában, vagy ezen formák keverékének alakjában van jelen, azzal jellemzve, hogy élesztőpromotert, és az említett promoterrel kontrollált TPA-t kódoló szakaszt tartalmazó hibrid-vektorral transzformált élesztótórzset, vagy olyan élesztőtörzset, melyben a szöveti plaz-
