201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
13 HU 201115 B 14 minogén aktivátor génje stabilan integrálódott egy élesztőkromoszómába és egy kromoszómába élesztópromoter kontrollja alatt áll, vagy ilyen élesztőtörzsek mutánsait megfelelő körülmények között tenyésztjük, a fenti fehérjéket izoláljuk és tisztítjuk és ha szükséges, a kapott TPA-pro-TPA keveréket szétválasztjuk komponenseire, pro-TPA mentes TPA előállítása céljából átalakítjuk a keletkezett pro-TPA-t, TPA-vá, és ha szükséges, a glikozilezett és glikozilezetlen termékek keverékéből elkülönítjük az egyes komponenseket, a glikozilezett fehérjétől mentes glikozilezetlen fehérje előállítása céljából a kapott fehérjékről eltávolítjuk a glikozil-csoportokat. aj A transzformált élesztősejtek növesztése A jelen találmány szerinti transzformált élesztősejteket emészthető szén- és nitrogénforrást valamint szervetlen sókat tartamazó tápfolyadékban növesztjük. Különböző szénforrásokat használhatunk. Az előnyös szénforrások emészthető szénhidrátok, például glükóz, maltóz, mannit vagy laktóz, vagy valamilyen acetát, melyet egyedül vagy megfelelő keverékekben használhatunk. A megfelelő nitrogénforrások közé tartoznak például az aminosavak, úgymint a kazaminosavak, peptidek és fehérjék valamint ezek lebomlási termékei, úgymint a Iripton, pepton vagy húskivonatok, továbbá az élesztőkivonat, malátakivonat, kukoricalekvár, valamint az ammóniumsók, úgymint az ammónium-klorid-szulfát vagy -nitrát, melyeket egyedül vagy megfelelő keverékekben használhatunk. A használható szervetlen sók közé tartoznak például a nátrium-, kálium-, magnézium-, és kalcium-ionok szulfát-, klorid-, foszfát- és karbonát-sói. A tápközeg ezenkívül tartalmazhat növekedésgyorsító anyagokat is. A növekedésgyorsító anyagok közé tartoznak például a nyomelemek, úgymint a vas, cink, mangán és hasonlók, vagy egyes aminosavak. Az autonóm replikálódó plazmidokkal, például élesztő 2 mikronos DNS-t tartalmazó plazmidokkal transzformált élesztősejtek bizonyos mértékig hajlamosak arra, hogy elveszítsék a bevitt hibrid plazmidot [lásd (13)]. Ezért ezeket az élesztósejteket szelektív körülmények között kell növeszteni, azaz olyan körülmények között, mikor a növekedéshez szükség van a plazmidon kódolt gén kifejeződésére. A jelenleg használt legtöbb szelektív marker aminosav vagy purin bioszintézisben résztvevő enzimet kódoló gén. Ez szükségessé teszi, hogy a megfelelő aminosavat vagy purinbázist nem tartalmazó, szitetikus minimál táptalajt használjunk. Néhány olyan gén is használható, mely egy megfelelő mérgező anyaggal szembeni rezisztenciát hordoz [például a cikloheximid, a G418 aminoglikozid (14), nehézfémek vagy hasonlókkal szembeni rezisztenciát hordozó gének]. Az antibiotikum rezisztenciát tartalmazó vektorokkal transzformáit élesztósejteket a megfelelő antibiotikumot tartalmazó komplex táptalajban növesztjük, így nagyobb növekedési-sebességet és nagyobb sejtsűrűséget kapunk. A kromoszómába integrálódó DNS-sel transzformált élesztösejtek növesztéséhez nincs szükség szelektiv növesztési körülményekre. Ezek a transzformált sejtek elég stabilak ahhoz, hogy szelektivnyomás nélkül is növeszthetők legyenek. A fenti okból ezeket a sejteket előnyösen koplex táptalajban növesztjük. Konstitutív promoterrel (például PH03 vagy ADUD rendelkező hibrid-plazmidot tartalmazó élesztösejtekben az említett promoterhez kapcsolt TPA gén indukció nélkül kifejeződik. Ha azonban a TPA gén szabályozott promoter (például GAPDH, PGK vagy PH05) kontrollja alatt van, a növesztő táptalaj összetételét úgy kell megválasztani, hogy a mRNS maximális szintjét kapjuk, például PH05 promoter használata esetén, a promoter derepressziója érdekében a növesztő táptalaj csak alacsony koncetrációban tartalmazhat szervetlen foszfátot. A tenyésztést szokásos technikával végezzük. A tenyésztési körülményeket, úgymint a hőmérsékletet, a táptalaj pH-ját és a fermentációs időt úgy határozzuk meg, hogy maximális mennyiségű TPA keletkezzen. A választott élesztőtörzs előnyösen aerob körülmények között, süllyesztett tenyészetben rázatva vagy kevertetve 25-35 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen körülbelül 30 °C-on, 4-8 pH között, például körülbelül 7-es pH-n, körülbelül 4-20 óráig, előnyösen a maximális mennyiségű fehérje keletkezéséig. b) A keletkezett TPA izolálása és tisztítása Miután a traszformáit élesztősejtek kielégítő sűrűségig nőttek, a keletkezett fehérje kinyerésének első lépése a fehérje kiszabadítása a sejt belsejéből. A legtöbb eljárásban először a sejtfalat távoiítják el glükozidáz enzimes emésztéssel (lásd 2. pont). Ezt követően a kapott szferoplasztokat felületaktív anyagokkal, például Tritonnal kezelik. Másik módszer szerint a sejtek feltárására mechanikai erőket, nyíróeróket (például X-press, French-press) vagy üveggyöngyökkel való rázatást alkalmaznak. A kapott fehérje keverékben szokásos módszerekkel dúsítjuk a TPA-t, úgymint a nem-fehérjeszerű anyagok eltávolítása polietilénimines kezeléssel, a fehérjék kicsapása triklórecetsavval vagy az oldat ammóniumszulfátos telítésével, gél-elektroforézissel, dialízissel, kromatográfiával, például ioncserélós kromatográfiával, méret-kizárásos kromatográfiával, HPLC-vel vagy reverz fázisú HPLC-vel, molekulaszüréssel 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
