201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
61 HU 201115 B 62 A táptalaj pll-ját sterilezés előtt nótrium-hidroxiddal 7,2-re állítjuk. A glükózt, vitaminokat és nyomelemeket külön sterilezzük, majd a táptalajhoz adjuk. A vitamin- és nyomelem-törzsoldatok összetétele a következő (g/l-ben): Vitaminok-biotin, 0,0002; kalcium D-pantotenát, 0,04; fólsav, 0,0002; nikotinsav, 0,04; p-amino-benzoesav, 0,02; piridoxin-hidroklorid 0,04; és inozit, 0,21 liter ionmentes vízben, nyomelemek- bórsav, 0,05; rézszulfát öt kristályvízzel, 0,004; kálium-jodid, 0,01; vas(III)-klorid hat kristályvízzel, 0,02; mangánÜD-szulfát négy kristályvízzel, 0,04; nátrium-molibdenát két kristályvízzel, 0,02 és cink-szulfát hét kristályvízzel, 0,04, egy liter ionmentes vízben. A táptalajt ionmentes viz felhasználásával készítjük. Az első elő-tenyószetet 24 órán ót 30 °C-on inkubáljuk 5 cm kitérésű körkörös rázógépen, 250/perc fordulatszámmal. Az első előtenyészetet használjuk a második elötenyésztó lombikok oltására. Ezeket a lombikokat 1 térfogatszózaléknyi oltóanyaggal oltjuk. A lombikok 100 ml II jelű, következő összetételű elötenyésztó táptalajt tartalmaznak (g/l-ben: Élesztókivonat, (Difco),10,0; L-aszparagin, 6,6; kálium-dihidrogén-foszfát, 1,0; magnézium-szulfát hét kristályvízzel 1,0; L-hisztidin, 0,02; és D-glukóz (monohidrát), 33,0; Az ionmentes vízzel készült táptalaj pll-ja körülbelül 6,0; A glükózt külön sterilezzük. Az inkubólós körülményei ugyanazok mint az első előtenyésztésnél. Három ilyen lombikból származó tenyészlevet egyesítünk, és ezt használjuk a fő, termelő fermentor 1 térfogatszázalékos oltóanyagaként. A termelő fermentor őssztérfogata körülbelül 45 1, 4 torlólemezt tartalmaz, valamint egy 115 mm átmérőjű, hat lapátos lemez turbinakeverőt. A keverő fordulatszáma 600/perc, a túlnyomás 0,03 MPa és a levegőztetés 0,5 v/v/perc. A fermentor 30 litert tartalmaz a kővetkező összetételű táptalajból (g/l-ben). L-aszparagin 2,0; L-hisztidin 0,02; kálium-dihidrogén-foszfát 0,03, magnézium-szulfát hét kristályvízzel 0,5; kólcium-klorid két kristályvízzel 0,1; kálium-klorid 1,0; glükóz (monohidrát) 20,0; vitamin-oldat 5 ml/1 és nyomelem-oldat 5 ml/1. A táptalaj pH-jót sterilezés előtt 7,2-re állítjuk nátrium-iiidroxiddal. A glükózt, vitaminokat és nyomelemeket külön sterilezzük és adjuk a táptalajhoz. A vitamin- és nyomelem-tőrzsoldat összetétele ugyanaz, mint az I jelű előtenyésztő táptalajnál használté. A fermenciós folyamatot 30 °C-on vezetjük. A pH-érték 5,0-re esik és ezen az értéken tartjuk nátrium-hidroxiddal. Körülbelül 20 órás fermentálás után érjük el a maximális TPA-termelést. Az optikai sűrűség, mely körülbelül 2-3 egységet ér el, valamint a savas foszfatáz aktivitás jól jellemzi a fermentációs folyamat előrehaladását. Az élesztősejtek öszszegyűjtése előtt 10 °C-ra hütjük a fermentlevet. 20. Példa A TPA és pvo-TPA kinyerése és tisztítása monokloriális anti-TPA antitest-kvomatográfiával a) Sejt-extrakció A 30 liter pH 4-es fermentlevet (lásd 19. példa) 10 °C-ra hütjük és egy Alfa-Laval BRPX-207 iszapmentesítő centrifugával lecentrifugáljuk. Az elválasztott sejteket 2 liter A jelű feltáró pufferban szuszpendáljuk (20 mM nótrium-di-hidrogén-foszfát, 80 mM dikólium-hidrogén-foszfót 150 mM nátrium-klorid, 0,01% Tween 10 mM benzamidin és 10 mM EDTA). Az oldatot 5 °C-ra hütjük majd 10 1/óra sebességgel KDL-Pilot típusú DynoR malmon bocsátjuk keresztül. A malomban 500 ml 0,5-0,75 mm átmérőjű üveggyöngy van és 3000/perc fordulatszámmal működik. Felhasználás előtt az üveggyöngyöket 300 ml olyan A feltáró pufferrel mossuk, melyben 30 mg BSA van. A feltárt sejtszuszpenziót lecentrifugáljuk (653-as Sorvall rotor, 40 perc, 9000/pLerc fordulatszám), és az üledéket kidobjuk. b) A DNS emésztése és ammónium-szulfátos fvakcionálás 5 mg DN-ázt adunk 2 liter felülúszóhoz és az elegye! 30 percig 4 °C-on tartjuk. Ezt követően az oldatot ammónium-szulfótra nézve 35%-osan telítetté tesszük, majd egy órán 4 °C-oii kevertetjük. Az oldatot lecentrifugáljuk a fentiek szerint, majd a teljes TPA- aktivitást tartalmazó üledéket 1 liter 1%-os Tween-t és 0,1% SDS-t tartalmazó A pufféiban szuszpendáljuk. A szuszpenziót legalább egy órán át 4 °C-on kevertetjük. c) Immun-affinitás kromatográfia I. Anti-TPA antitest tisztítása 5 ml nyúl anti-TPA antiszérumot (Dr. E.Reich szívességéből, Friedric-Miescher-Institut, Basel) lizin-szefaróz oszlopon bocsátunk keresztül, hogy a plazminogént eltávolitsuk a szérumból. Az oszlopot 1-2 térfogat pH 7,4-es PBS-sel mossuk, melynek összetétele: 100 mM nátrium-klorid, 2,7 mM kálium-klorid, 8,1 mM dinátrium-hidrogén-foszfát, és 1,5 mM kálium—dihidrogén—foszfát. Az átfolyó oldatot és a mosófolyadékot összegyűjtjük. A plazminogén-mentesitett anti-szérumot 50 v% végkoncentrációban hozzáadott ammónium-szulfáttal kicsapjuk. Az oldatot éjszakán át 4 °C-on tartjuk, majd lecentrifugáljuk (Sorvall GSA rotor 12000/perc, 20 perc). A csapadékot kislérfogatú PBS-ben, oldjuk, majd 0,1% nátrium-azidot tartalmazó PBS-sel szemben dializáljuk. Ebből a dializált oldatból az IgG-t protein A szefaróz oszlopon tisztítjuk (55). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 33
