201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
63 HU 201115 B 64 II. Anti-TPA antitestoszlop készítése 13 mg tisztított anti-TPA-t 0,1 M (pH 7,0) MOPS-pufferrel szemben dializálunk. Az antitestet 5 ml aktivált Affigel 10-hez (Biorad) kapcsolunk, az előállító előirása szerint. A gél-mátrixot 1% Tween 80-at 0,1% SDS-t, 0,2 M nátrium-kloridot, 10 mM benzamidint és 0,1% nátrium-azidot tartalmazó PBS-sel hozzuk egyensúlyba. A mátrixot 5 ml-es oszlopba töltjük. III. A TPA tisztítása immun-affinitás kromatográfiá val Az ammónium-szulfátos frakcionálós után kapott, beoldott üledéket a lebegő szemcsés anyagok eltávolítására lecentrifugéljuk (Sorvall GSA rotor, 12000/perc, 30 perc), majd ezt követően az affinitás-kromatográfiás oszlopra visszük, körülbelül 10 ml/óra táplálási sebességgel, 4 °C-on. Miután a teljes térfogatot átbocsátottuk, az oszlopot mossuk 10 térfogat 0,05% Tween 80-at tartalmazó PBS-oldattal. Az oszlopot 0,1% Tween tartalmazó 0,1 M glicin-HCl (PH 2,5) oldatul eluáljuk. 2 ml-es frakciókat szedünk és a TPA-aktivitést Ranby (49) módszerével mérjük. D-Val-Leu-Lys-pNA-t (Kabi S-2251) használunk szubsztrátként. A legnagyobb aktivitású frakciókat egyesijük, 1 M Tris-szel semlegesítjük és Amicon YM 10 membránt alkalmazva ultraszúréssel töményítjük. Az Így nyert TPA körülbelül 90% tiszUságú, és főleg az egyláncú formában (pro-TPA) fordul elő, a redukáló körülmények között SDS-PAGE eredményei alapján. Nem-redukáló körülmények között végzett SDS-PAGE alapján látszólagos molekulasúlya körülbelül 60 000 (lásd A ábra). A és B ábra: az élesztő TPA-géntermékének SDS-poliakrilamid gélelektroforézise (A ábra) és ennek aktivitása aktivitás-gélen (kazein-lemezek) (B ábra). 21 21. Példa A TPA és pro-TPA kinyerése és tisztítása DE-3 affinitáskromatográfiá val a) DE-3 Sepharose* oszlop készítése 26 mg, Erythrina latissima-ból (16) kinyert, tisztított DE-3 inhibitort 5 ml, brómciánnal aktivált Sepharose 4bí^-hez (Pharmacia) kapcsolunk, az előállító előírásai szerint. A mátrixot pH 7,4-es, 0,4 M nátrium-kloridot, 0,1% Triton X-100R-t és 0,02% nátrium-azidot UrUlmazó, foszfátul pufferolt sóoldattal (.PBS‘) hozzuk egyensúlyba. A mátrixot ezu- Un egy 5 ml-es oszlopba töltjük. b) A TPA és pro-TPA kromatográfiás tisztítása DE-3 Sepharose 41& oszlopon A sejtkivonat (20a példa) nátrium-klorid koncentrációját 0,4 M-ra, a Triton X-10C© koncentrációját 0,1%-ra állítjuk, majd 0,45 pm pórusméretü Millipore membránon szűrjük ét. Az oldatot ezután 45 ml/óra Uplélási sebességgel, szobahőmérsékleten a DE-3 Sepharose® oszlopra visszük: (lásd fent) majd az átfolyó oldatot kidobjuk. MiuUn az összes sejtkivonatot átbocsájtottuk az oszlopon, az oszlopot körülbelül 50 ml, 0,4 M nátrium-kloridot és 0,1% Triton X-100®-t UrUlmazó PBS-sel mossuk, és 4 °C-on 2 ml-es frakciókat szedünk. Mindegyik frakció fehérjeUr- Ulmát a 280 nm-es UV-elnyelés alapján határozzuk meg. Az adszorbeált fehérje éles csúcs formájában eluálódik. A legmagasabb UV elnyelést és legmagassabb fibrinolitikus aktivitást /125I-fibrin-assay alapján (47) mu- Utó frakciókat egyesítjük 8 ml térfogatban és -20~°C-on tároljuk. Ez az oszlopra vitt összes aktiviUsnak körülbelül 70-80%-át jelenti. Az alacsonyabb aktiviUsú frakciókat külön gyűjtjük. A két külön gyűjtött frakció álUlában 90-100%-át UrUlmazza az aktivitásnak. c) A pro-TPA kromatográfiás tisztítása DE-3 Sepharose 4kP-n, proteináz inhibitor jelenlétében Az élesztősejt-kivonat kromatográfiáját a 21b példában leírthoz hasonló módon végezzük, azzal a különbséggel, hogy az eljárás során 0,1 KIU/ml koncentrációban bézikus pankreatikus tripszin-inhibitort (BPTI) használunk. A Cbz-Gly-Glu-Arg-AMC-t szubsztrátként alkalmazó fluorimetriás vizsgálatul (37) meghatározzuk a tisztított oldat TPA és pro-TPA UrUlmát. A TPA 90%-a pro -enzim formájában van jelen, 10%-a van aktív formában. Tehát a pro-TPA-nak TPA-vé alakulását a tisztítási eljárás során a BPTI gátolja. 22. Példa A pro-TPA elválasztása a TPA-tói A 21c. példa szerint előállított TPA és pro-TPA oldat pH-ját 8,0-ra állítjuk 0,1% Triton X-lOd&t UrUlmazó 0,1 M TRIS-HCl-lel, majd 1 mM végkoncentrációban di-izopropil-fluorofoszfátot adunk hozzá. 4 órán át inkubáljuk 37 °C-on, majd az elegyet 5 ml térfogatú DE-3 Sepharose* oszlopon (lásd 21a példa) bocsátjuk át. Az irreverzibilisen gátolt TPA-t UrUlmazó átfolyó oldatot eldobjuk. Az oszlopot 6 térfogat, 0,4 M nátrium-kloridot és 0,1% Triton X-lOdÖ-et UrUlmazó PBS-sel mossuk, majd 1,6 M kálium-rodani-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 34
