201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
59 HU 201115 13 60 A PH05 gén kicserélése a kromoszómán a TPA génnel (lásd 25. ábra) A TPA fehérjét kódoló szakaszt a II élesztőkromoszómába építjük be a PH05 fehérjét kódoló szakasz helyébe. Kísérletileg ezt ko-transzformálással visszük véghez. A Saccharomyces cei'evisiae GRF18 törzset ko-transzforméljuk 25 pg p31 /PU05- TPA18 piazmiddal, melyet BamHI- és HindlII restrikciós endonukleázzal linearizálunk, valamint 3 pg Yepl3 élesztöplazmiddal (51.). A kapott 24 Leu* telep közül egy PH05- és ugyanakkor körülbelül 35 egység/liter élesztősejt tenyészet/ODcoo-at termel. Ezt a transzforménst 10 generáción keresztül leucin-tartalma táptalajon növesztve (YPD, 10 g/1 Bacto Yest Extract, 20 g/1 Bacto Peptone, 20 g/1 glükóz) 10-20%-ban Leur szegregánst kapunk, melyek valószínűleg elvesztették az Yepl3 plazmidot. A Leír szegregánsokból (52) izolált össz-élesztő DNS Southern analízisével DNS-sziriten igazolni lehet, hogy a TPA fehérjét kódoló szakasz helyettesíti a PH05 fehérjét kódoló szakaszt, változatlanul hagyva a II kromoszómán a kísérő DNS-szakaszokat, és a törzsek nem tartalmazzák az Yepl3 plazmid DNS-t. Egy törzset kiválasztunk és Saccharomyces cerevisiae GRF18 (pho5-TPA) jelöléssel látjuk el. 17. Példa 18. Példa Tőrzsjavítés mutációval A Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/P«O5-TPA (1A) törzs TPA-termelő képességét továbbfejlesztjük mutációval és alacsony foszfatáz aktivitásra szelektálva. A Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB207/P//O5-TPA (1A) törzs a Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PPÜ5-TPA (1A) törzs hőmérsékleL-érzékeny mutánsa, melyet UV-besugárzással (0,08 pW cm-2, 15 másodperc, pusztulás 99,2%) állítunk elő. A telepeket 1,2 M szorbittal ozmotikusán stabilizált YPD táptalajon (10 g/1 Bacto Yeast Extract, 20 g/1 Bacto Peptone, 20 g/1 glükóz, 20 g/1 Bacto agar) növesztjük és szorbiol nélküli YPD táptalajra replikázzuk. A Saccharomyces cerevisiae 11243-at egy lassan növő telep formájában izoláljuk. Körülbelül 105 Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB207/P//O5-TPA (1A) sejtet szélesztünk YNB agarra (6,8 1 Yeast Nitrogén Base aminosavak nélkül: 20 g/1 glükóz, 20 g/1, Bacto Agar, 20 mg/1 hiszlidinnel kiegészítve) és közvetlenül besugározzuk UV fénnyel (0,08 pW cm2 12 másodperc). A pusztulás 98%-os. A túlélő sejtekből izolált telepeket alacsony Pi-tartalmú táptalajra replikázzuk és 2 nap elteltével a savas foszfatáz aktivitás vizsgálata céljából a lágyagar-felülrétegezési vizsgálat (48) alapján megfestjük. Savas foszfatáz-negatív mutánsokat 3,2 x 10"4 mutációs frekvenciával kapunk. A legmagasabb TPA-ti terű törzset kiválasztjuk és Saccharomyces cerevisiae H433/pJDB207/ /P1105-TPA (1A) jelöléssel látjuk el. A PJDB207/P//OS-TPA (1A) piazmiddal transzformált három különböző élesztőtörzs TPA-aktivitását mutatjuk be a 4. táblázatban. ■1. Táblázat Különböző transzformált Saccharomyces cerevisiae törzsek TPA aktivitása derepresszált körülmények (alacsony Pí) között TPA aktivitás (egység/1 élesztő sejt-tenyészet/OD60o) GRF18/pJDB207/P//ü5-TPA( 1A) 625 H243/pJI)B207/P//O5-TPA( 1A) 1560 H423/pJDB207/PH05-TPM1A) 7200 19. Példa TPA előállítása 30 literes térfogatban egy Saccharomyces cerevisiae rekombináns törzszsel A Saccharomyces cerevisiae GRF18/PJDB207/PI105-TVA (1A) törzs olyan plazmidot tartalmaz, melyben a plazmidnak a gazdaszervezetben való szelektív fennmaradását lehetővé tevő leucin-marker, a humán TPA struktúr-génje, valamint a PH05 savas foszfatáz promotere található. Az utóbbi teszi lehetővé a TPA gén kifejeződését korlátozott mennyiségű szervetlen foszfátot tartalmazó táptalajon (depresszált körülmények). A törzset ferde-agar tenyészet formájában tartjuk fenn, a plazmid megmaradását biztosító leucin-mentes táptalajon. A frissen oltott ferdéket 24 órán át 30 °C-on inkubáljuk. Egy ferde-agar felületén kinőtt tenyészetet 3 ml előtenyésztő táptalajban szuszpendálunk, majd az első előtenyésztő rázott lombikba visszük. Az 500 ml-es lombikban egy torló található és 100 ml, következő öszszetótelü I jelű táptalajt teszünk bele (az értékek g/1-ben értendők): i,-aszparagin, 2,0; 1,-hisztidin, 0,02; glükóz, 10; kálium-dihidrogén-foszfát, 1,0; magnézium-szulfát két kristály vízzel, 0,5; nátrium-klorid, 0,1; kálcium-klorid két kristályvízzel 0,1; vital.min-oldat. 5 nil/1 és nyomelemoldat, 5 nil/1. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 32
