201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
57 HU 201115 D 58 16. Példa A fenti gén-konstrukciók szubklónozása a nagy kópia-számú pJDD 207 élesztővektorban és transzformálása S.Cerevisiae GRF18-ba 5 A 13-15. példákban leint konstrukciók tartalmazzák a PH05 promotert a PH05 gén kódoló szakaszával vagy anélkül, a TPA-t kódoló szakaszt a prepro-szakasszal vagy 10 anélkül, valamint a PH05 transzkripciós términációs jeleket egymás utáni sorrendben elrendezve, és az egészet egy pBR322-ből származó vektorba beépítve. Az egész tömböt tartalmazó BamHI-HindlIl fragmentet a pJDB 15 6,4 kb méretű BamHI-HindlII fragmentjóhez ligáljuk, a 10. példában leírt reakcióval analóg módon. Kompetens E. coli HB101 sejteket transzformálunk, és mindegyik kísérletből néhány ampR telepet növesztünk fel külön- 20 -külön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-t HindlII, BaniHI és PstI restrikciós endonukleázokkal hasítva analizáljuk. A P31/P//05-TPA18, p31/P//05-TPA42, 25 p31R/SS-TPAA 2, P31R/SS-TPAa 3, p31/PH05 595C-TPA, p31 /PH05 637C-TPA, P31/PH05 811C-TPA, p31 /PH05 1312C-TPA, p31 / P1I05 595B-TPA, p31/PH05 637B-TPA, p31/PH05 811B-TPA, P31 /PH05 1312B-TPA, p3í/P1105 30 595-TPA, p31/Pl105 637A-TPA, p31 /PH05 811A-TPA- és p31/P//05 1312A-TPA plazmidokból a következő, korrekt beépitett DNS-szakaszt tartalmazó kiónokat kapjuk: p Jl) B 207 / Pl 105- T PA 18 PJDB207/77/O5-TPA42 PJDB207R/P//O5-SS-TPAa 2 pJDB207 R/P/f 05-SS-TPAa 3 PJDB207/P1I05 595C-TPA PJDB207/PROS 637C-TPA PJUB207/P1105 811C-TPA PJDB207/PI105 1312C-TPA PJDB207/P1I05 595B-TPA pJDB207/P1105 637B-TPA PJDB207/P1I05 811B-TPA PJDB207/PI105 1312-TPA P.JDB207/P1I05 595A-TPA pJDB207/P//O5 637A-TPA PJDB207/PH05 811A-TPA PJDD207/PI105 1312A-TPA. Ezeket a plazmidokat Saccharomyces cerevisiae GRF18 törzsbe transzformáljuk a 11. példában leirt módon. Minden egyes élesztő-transzformációs kísérletből egy telepet izolálunk. A kapott kiónokat Saccharomyces cerevisiae GRF 18/pJDB207/PW05-TPA18 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/P//O5-TPA42 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/P//O5-SS-TPAa 2 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/P//05-SS-TPAa 3 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/P//Oő-595C-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/P//O5-637-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/P1I05 811C-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/P1105 1312C-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/P1105 595B-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 637B-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/P//O5 811B-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF 18/pJDB207/PPO5 1312-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 595A-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 637A-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 811A-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 1312A-TPA jelöléssel látjuk el. 50 Az élesztősejteket a 11. és 12. példában leírt módon növesztjük, gyűjtjük össze és extraháljuk. A sejt-extraktumokban mérhető TPA-aktivitást a 12. példában leírt módon vizsgáljuk. Az eredményeket a 3. táblázatban 55 mutatjuk be. 3. táblázat Különböző plazmidokkal transzformált és derepresszélt körülmények között (alacsony Pi) vizsgált Saccharomyces cerevisiae GRF18 éleszlőtörzs TPA-ak ti vitása Plazmid TPA aktivitás egys/1 élesztősejt tenyészet/01)60o) pj 1)1)207/ P//05-T PA 18 750 pJDD207/P1I05-T PA42 700 pJI)B2071í/ P//05-SS-TPAa 2 600 PJDB207R/PPO5-SS-TPAA 3 650 pJDU207//7/O5 595C-TPA 900 31
