201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
55 HU 201115 B 56 9Aa példában leírt módon etanollal kicsapjuk. A ö'-CTAGAAGGGGTATCTTTGGATAAGA -3’ 3’- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5’ képletü két szintetikus oligonukleotidot külön-külön foszforilezük az 5' végükön a 9Ab példában leirt módon. A foszforilezett oligodezoxinukleotidokat ekvimoláris mennyiségben összekeverjük. Az elegyet 10 percig 75 UC-on tartjuk, majd hagyjuk lassan szobahőmérsékletre hűlni, és -20 “C-on tároljuk. Ezt a linkért nevezzük C linkernek. 1 pg (120 pmól) foszforilezett, kettősszálú C linkért és 5 pg (1,5 pmol) Xba 1-gyel hasított, defoszforilezett pDR322/PH05 Bams-Rsa 637 plazmidot 1600 egység T4 DNS-ligázzal 15 °C-on 20 órán át ligálunk 40 pl 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 inM mugnézium-klorid, 5 mM DTT és 1 mM ATP összetételű pufferban. A DNS ligázt 10 percig 85 °C-on tartva inaktiváljuk, majd a linker feleslegét izopropanolos kicsapással eltávolítjuk. A DNS-t 0,25 mg/ml koncentrációban vízben oldjuk. A többszörös linkereket Bglll restrikciós endonukleázzal való emésztéssel eltávolítjuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk újra oldjuk és Bamlll-gyel tovább emésztjük. A restrikciós fi-agmenteket 0,6%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen, Tris-borát-EDTA (pH 8,3) pufferban választuk el. A 662 bp méretű BamlII-BglII fragmentet (a 637 méretű BamHI-Rsal fragmentből származik) lokalizáljuk és kivágjuk a gélből. c) Az érett TPA-t kódoló szakaszt tartalmazó vektor-fragment izolálása (23. ábra) 5 pg p31R/SS-TPAa 2, plazmidot BamlII és Bglll restrikciós endonuklázokkal emésztünk. Teljes megemésztödés utón a DNS-t etanollal kicsapjuk és 75 pg/ml koncentrációban 50 mM TRIS-HCL (pH 8,0) pufferban oldjuk. A DNS-fragmenteket 5’ végeiken defoszforilezzük 1 egység borjúból alkalikus foszfatázzal (Boehringer) 1 órán át 37 °C-on emésztve 60 pl 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) pufferban. A foszfatázt 1,5 órán át 65 °C-on inkubólva inaktiváljuk. A DNS-t. a 9Aa példában leirt módon DE52 (Whatman) ioncserélő kromatográval tisztítjuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) pufferban oldjuk, majd 0,6%-os alacsony olvadáspontú gélre visszük. Az 5,2 kb méretű BamlII-BglII fragmentet kivágjuk a gélből. d) Az izolált DNS-fragment ligálása és transzformálása E. coli HB101-be (lásd 23. és 24. példa) A p31R/SS-TPAa-25,2 kb méretű Bamlll—Bglll fragmentjéből 0,1 pmólt és a pBR322/PH05 Bam-Rsa 637 622 bp méretű BamHI-BglII fragmentjéből 0,2 pmólt tartalmazó alacsony olvadáspontú agaróz gélblokkot megolvasztunk 65 °C-on összekeverünk és az agaróz-koncentróció 0,3%-ra csökkentése érdekében vízzel hígítunk. A ligálást 800 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) 16 órán ót 15 °C-on végezzük 150 pl 60 iuM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT és 1 mM ATP összetételű oldatban. 10 pl és 30 pl-es alikvot részeket keverünk 100- -100 pl transzformációra kompetens E. coli HB101 sejttel a 4a példában leírt módon. 6 ampR transzformált telepet növesztünk kü~ lön-külön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-L a beépített DNS-szakasz mérete és orientációja szempontjából vizsgáljuk BamlII restrikciós endonukleázos emésztéssel. A beépített. DNS-t a korrekt orientációba tartalmazó egyik klónl p31 /PH05 637 C-TPA jelöléssel látjuk el (lásd 23. ábra) A pBR322/i'//U5 Bam-Rsa 637 plazmidot helyettesíthetjük a pBR322/PlIOö Bam-Rsa595, PBR322/P//05 Bam-Rsa 811 és pBR322/P//05 Bam-Rsal312 plazmidokkal. A fent leirt eljárást követve a várt méretű és orientációjú DNS-szakaszt tartalmazó kiónokat izoláljuk és a p3í/PI105 595 C-TPA, p31 /PH05 811 C-TPA és p31//'//05 1312 C-TPA jelöléssel látjuk el. A C linkért is helyettesíthejtük a 5’- CTAGATAAGAGATCTGC -3’ TATTCTCTAGACG -5’ képletü B linkerrel. A szintetikus oligodezoxinukleotidok foszfor ilezését, párosítását és a megfelelő DNS fragmenthez való kötését a C linkerre leírt módon végezzük. A kapott kiónokat B betűvel jelöljük, és p31 / PII05 595B-TPA, P31/PH05 637B-TPA p31/PW05 811-TPA és p31 / PH05 1312B-TPA jelöléssel látjuk el. Ezekben a konstrukciókban a B linker a Leu-Asp-Lys-Arg aminosavakat kódolja. A C linkért a 5’- AAGAGATCTGC -3’ 3’- TTCTCTAGACG -5’ képletü A linkerrel is helyettesíthejük, mely a végső konstrukcióban (24. ábra) a Lys-Arg aminosavakat kódolja. A szintetikus oligodezoxinukleotidok foszforilezését és párosítását a C linkerre leirt módon végezzük. A linker hozzáadás céljából 5 pg Xbal restrikciós endonukleázzal hasított PBR322IP1105 Bam-Rsa637 DNS-t 2 egység Sí nukleázzal (Sigma) emésztünk (tompa végű DNS-t állítunk elő) 50 pl 30 mM nótriuin-acetát (pH 4,6) 200 mM nátrium-klorid és 1 mM cink-szulfát összetételű oldatban, 40 perces 37 °C-os inkubólással (lásd 23. ábra). Fenol-kloroformos extrakció után a DNS-t eLanollal kicsapjuk, majd 0,25 mg/ml koncentrációban vízben oldjuk. 0,4 pg (120 pmól) foszforilezett, párosított A linkért, és 5 pg (1,5 pmól) Xbal/Si-gyel hasított ptiU322/P1105 Bam-Rsa637 DNS-t kötünk össze tompa végű ligólással a C linkerre leírt módon, azzal a különbséggel, hogy 3,5 mM ATP-t használunk. A további konstrukciókat a fentiek szerint készítjük. A kapott kiónokat A betűvel azonosítjuk és \i'il/P1105 595A-TPA P31/ Pl105 637A-TPA, p31 /PI105 811A-TPA és p31/0H05 13J2A-TPA jelöléssel látjuk el. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 30
