201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
53 HU 201115 B 54 donukleázokkal hasítjuk, majd a PII05 és PH03 géneket tartalmazó 3,9 kb méretű fragmentet preparatív gélelektroforézissel izoláljuk. A 3,9 kb méretű BamHI-Hpal fragmentet BamHI és PvuII restrikciós endonukleázokkal hasított pBR322 vektorban klónozzuk. Az igy kapott, a PH05 és PÍ103 géneket tartalmazó plazmidot p29 jelzéssel látjuk el. A p29 plazmidból 30 pg-ot BamHI és EcoRII restrikciós endonukleézzokkal emésztünk. Teljes megemésztödés után a DNS-t fenol-kloroformmal extrahéljuk és etanollal kicsapjuk. A DNS-t 0,5 mg/ml koncenLrációban 10 mM Tris-HCL (pH8) pufferban oldjuk. 15 /ug BamHI és EcoRI restrikciós endonukleázokkal hasított p29 plazmidot részlegesen emésztünk Rsal restrikciós endonukleázzal (0,9 egység/pg DNS) 37 °C-on 45 percig inkubálva 300 pl 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) 6 mM magnézium-klorid 50 mM nátrium-klorid, 6 mM merkapto-etanol és 5 pg/ml etidium-bromid összetételű pufferban. Az emésztést fenolos extrakcióval állítjuk le. A DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 1 mg/ml koncentrációban vízben oldjuk. A 5’-CTAGATCTAG-3' képletü oligodezoxinukleotidot az 5' végén foszforilezzük, majd önmagával párosítjuk a 9Ab példában leírtak szerint. 4 pg (1400 pmol) foszforilezett és kétszálúvá tett linker DNS-t 14 pg (140 pmol) emésztett p29 DNS-sel (lásd fent) ligálunk, 16 órán át 20 °C-on 3200 egység T4 DNS ligázzal inkubálva 80 pl 60 mM Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM magnézium-klorid, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT összetételű pufferban. A T4 DNS ligázt 10 percig 65 °C-on tartva inaktiváljuk. A linker feleslegét 10 mM EDTA és 300 mM nátrium-acetát (pH 6,0) jelenlétében 0,54 térfogat izopi-opil-alkohollal kicsapjuk. A DNS-t BamHI és Xbal restrikciós endonukleázokkal emésztve (4 egység/pg DNS) eltávolítjuk a többszörös linker molekulákat és Xbal tapadós végeket kapunk. A tompa végű RasI hasítási helyekhez való linker hozzáadásával majd ezt követően a linker Xbal restrikciós endonukleázzal való hasításával az összes p29 Bamlll-Rsal restrikciós fragmentet BamHI-Xbal fragmentté alakítjuk, majd 1%-os alacsony olvadáspontú gélen, Tris-borát EDTA (pH 8,3) pufferban szétválasztjuk. Az 595 bp 637 bp, 811 bp vagy 1312 bp méretű BamHI-Xbal fragmenteket tartalmazó géldarabokat kivágjuk a gélből. A pBR322/PH05 Eco-Bam plazmid a pG7 plazmidból származik (2. példa). A pG7-et EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázzal hasítjuk. A kapott DNS-fragmenteket preparatív gél-eletroforézissel választjuk el. A 2.1 kb méretű EcoRI-BamHI fragmentet izoláljuk, mely a PI105 BamHI hasítási helyétől 5’ irányban található szakaszt tartalmazza. A 2.1 kb méretű fragmentet a pBR322 vektor 4 kb méretű EcoRI-BamHI fragmentjével ligáljuk. A kapott plazmid jelzése píití322/PI105 Eco-Bam. A pBR322/PII05 plazmidban található a PII05 BamHI hasitási helyétől 5’ irányban terjedő DNS-szakaszt tartalmazó 2,1 kb méretű EcoRI-BamHI fragment, 15 pg plazmid DNS-t emésztünk BamHI és Xbal restrikciós endonukleázokkal. A restrikciós fragmenteket 0,6%-os alacsony olvadáspontú gélen TRIS-borát-EDTA (pH 8,3) pufferban választjuk el. A 4,25 kb méretű BamHI-Xbal fragmentet kivágjuk a gélből. A DNS fragmenteket tartalmazó géldarabokat 65 °C-on megolvasztjuk, majd az agaróz-koncentráció 0,3%-ra csökkentése céljából vízzel hígítjuk. A 637 bp méretű BamHI-Xbal fragment és a 4,25 kb méretű BamHI-Xbal vektor-fragment ekvimoláris mennyiségét összekeverjük és 600 egység T4 DNS-ligázzal 16 órán át 15 °C-on inkubáljuk 125 pl 60 mM TR1S-HC1 (ph 7,5) 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT, 1 mM ATP összetételű pufferban. A ligéió elegyből 10 pl-t 100 pl transzformácóra kompetens E. coli HB101 sejtekhez adunk, a 4a. példában leírtak szerint. 5 ainpR telepet növesztünk külön-külön 100 pg/ml ampcicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-be beépített DNS-szakasz méretét EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel vizsgáljuk. A kivént DNS-darabot tartalmazó kiónt pBR322/P//OÄ Bam-Rsa637 jelöléssel látjuk el. A 637 bp méretű BamHI-Xbal fragmentet helyettesíthetjük az 595 bp, 811 bp vagy 1312 bp méretű BamHI-Xbal fragmenttel. A kívánt méretű beépített DNS-szakaszt tartalmazó kiónok közül egyet-egyet pBR322/PH05 Bam-Rsa595, pBR322 / PROS Bam-Rsa811 és pBR322/PHG5 Bam-Iísa 1312 jelölésssel látunk el. b) Szintetikus oligodezoxinukleotidok hozzáadása: A 637 bp méretű BamHI-Xbal fragment tartalmazza a PÍI05 promotert, valamint az érett savas foszfatázt kódoló szakasz 637 nukleotidjénál levő Rasl hasitási helyig terjedő szakasszal meghosszabbított PH05 szignál-szakaszt. A DNS-fragmentet leolvasási fázisban kapcsoljuk az érett TPA-t kódoló szakaszhoz a Leu-Geu-Gly-Val-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg oligopeptidet kódoló oligodezoxinukleotid linkeren keresztül. Ez a szakasz megtalálható még az élesztő alfa-faktort kódoló szakasztól (54) 5’ irányban. 5 pg pBR322/PH05 Bam-Rsa plazmidot Xbal restrikciós endonukleázzal emésztünk. Teljes megemésztés után a DNS-t fenol-kloroformmal extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. A DNS-I. 50 pg/ml koncentrációban 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) pufferban oldjuk, majd 11 egység borjúbél alkalikus foszfatázzal (Boehringer) egy órán át 37 °0-on emésztjük. Az enzimet 1 órán át 65 “C-on tartva inuktiváljuk. A DNS-t DE52 (Whatman) ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk, majd a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 29
