201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
33 IIU 201115 B 34 egyesítjük és a nukleinsavakat 0,3 M végkoncentrációjú NaCl és 25 pg/ml végkoncentrációjú tRNS valamint 3 térfogat entanol hozzáadásával kicsapjuk. 20 pg dCTP-vel meghosszabbított ds cDNS-t összekötjük 60 ng, a PsTI helyen dG-vel meghosszabbított pBR 322-vel, 20 /ul 0,4 M nátrium-klorid, 10 niM TRIS.HC1 (pH7,5) 1 mM BDTA összetételű oldatban 10 percig 65 °C-on 2 órán át 45 °C-on, 2 órán át 22 °C-on tartva, majd lassan, éjszakán át 4 °C-ra hűtve a reakcióelegyet. Az össszekapcsolt cDNS-t 0 °C-on 100 pl kompetens E. coli HB101/LM1035 (33) szuszpenzióval keverjük össze. A baktérium-szuszpenziót 15 percig 0 °C-on, majd 5 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd 1,9 ,ml LB táptalajt adunk hozzá és az inkubálást további két órán folytatjuk 37 °C-on. A selejteket 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó LB agarlemezekre szélesztjük. Egy nanogramm vektorból 100 transzformánst kapunk, 13% újra összezáródott vektorral, mint háttérrel. 5400 transzformánst izolálunk steril fogpiszkálóval 96 lukas mikrotiter-lemezekben levő, 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó 200 pl LB táptalajba, éjszakán át növesztjük 37 °C-on, majd 5 térfX glicerin hozzáadása után -80 °C-on tároljuk. cl TPA-DNS szakaszok keresése A humán szöveti plazminogén aktivátor cDNS két szintetikus oligonukleotidját d5’-GGCAAAGATGGCAGCCTGCAAG-3’ és d5’-GCTGTACTGTCTCAGGCCGCAG-3' a módosított triészter módszerrel (35) állítjuk elő, majd reverz fázisú HPLC-vel és preparativ poliakrilamid elektroforézissel tisztítjuk. Az oligonukleotidokat az 5’ végükön T4 kinázzal, (oC32P/ATP-vel (New England Nuclear) .jelöljük, így lxlO6 cpm (Cserenkov) pmól (10) specifikus aktivitást kapunk. A mikrotiter lemezeket megolvasztjuk, és a transzformált tenyészeteket 6x8-as rácsozattal beosztott 82 mm-es HATÉ nitrocellulóz szűrökre visszük. 18 órán át 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó LB agarlemezen növesztjük, majd a plazmidokat 12 órán ét 10 pg/ml tetraciklint és 10 pg/ml kloramfenikolt tartalmazó LB agarlemezeken amplifikáljuk. A DNS-t rögzítjük a szűrőkhöz oly módon, hogy 3 percre lOX-os SDS-el telített Whatman 3 M papírra tesszük a szűrőket, majd ezt követően 0,5 N nétrium-hideroxiddal és 1,5 M nátrium-kloriddal telített szűrőpapírra 5 percig, 0,5 M TRis.HCl (pH8), 1,5 M nétrium-kloriddal telitett szűrőpapírra 5 percig, végül 2 x SSPE oldattal (SSPE: 0,15 M nétriuin-klorid, 10 mM nátrium-dihidrogén-foszfát, pH7,4 1 mM EDTA) telített szűrőpapírra 5 percig (42). A szűrőket levegőn megszáritjuk, vákuumban 2 órán át 80 °C-on, .sütjük". Az így kezelt szűrőket 2 órán át, 37 °C-on mossuk 50 mM TRIS.HC1 (pH7,5), 10 mM EDTA, 1M nátrium-klorid és 1% SDS gr, összetételű oldattal a bakteriális törmelék eltávolítására. A hibridizálást és mosást Wallace és munkatársai (1981) által leírt módszerrel végezzük, felhasználva a nukleotid-hossz, 5 aG+C tartalom és a Ttn közötti tapasztalati összefüggést, melyet Suggs és munkatársai (45) valamint Smith (46) határozott meg. A szűrőket kél ólán át pre-hibridizáljuk majd 12 órán át hibridizéljuk 60 °C-on 1,6 ml 10 900 mM nátrium-klorid 60 mM nétrium-dihidrogén-foszfát, (pll7,4), 7,2 mM EDTA (6xSSPE) összetételű oldutban, mely 0,1.0,1% BSA-t, polivinilpirrolidont, Eicoll 400-at (5x Denhardt oldat). 200 pg/ml tRNS-L és 0,1% SDS-t tar- 15 talinaz. A két 3ZP-vel jelölt oligonukleotidból álló keveréket 0,3 pmol/ml koncentrációban a pre-hibridizáló oldathoz adjuk. A hibridizálást követően a szűrőket 6xSSC oldattal mossuk (SSC: 0,15 mM nátrium-klorid, 15 mM tri- 20 nátrium-citrát), 3x10 percig 4 °C-on majd 3x10 percig 60 °C-on. A szárított szűrőket Kodak XB5 röntgenfilmre exponáljuk Dupont intenzitás-növelő betéttel (.screen') 36 órán át -70 °C-on. A hibridizálást mutató inikroli- 25 tér lukakat azonosítjuk, és az ezekből a tenyészetekből származó egyedi telepeket a fenti módon átvizsgáljuk, duplikát szűrőket külön-külön hibridizálva az egyes próbákhoz. A szűrők hibridizálását és mosását 63 °C-on 30 végezzük. Mindkét próbával külön-külön hibridizáló telepeket izoláljuk az anyalemezről és éjszakán át 37 C-on növesztjük 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó LB táptalajban. Ezek közül a telepek közül az egyiket a pW349F- 35 -nek nevezzük. A plazmid DNS előállítására a módosított alkalikus lizis módszerét (36) használjuk, majd cézium-klorid gradiens-centrifugálást. A pW349E plazmid DNS-ét PstI és BglII 40 restrikciós endonukleázokkal emésztve vizsgáljuk. A restrikciós fragmenlek mérete azonos a várttal. Ebből arra következtetünk, hogy a pW349E plazmid (7,1 kb) a humán szöveti plazminogén aktivátor teljes struk- 45 turgénjét tartalmazza. d) A TPA cfíNS klón nukleoLid-soi— rendje (lásd 11. ábra 50 Maxam és Gilbert (10) és Sanger módszerének (53) kombinációját használva szekvenáljuk a TPA cDNS kiónt. Az eredmények a 11. ábrán láLhalók. A nukleotid sorrendet összehasonlítva a Pennica és munkatársai ál- 35 tál közölttel (7), csak egy változás figyelhető meg a 113-as ruikleotidnál, mely a TPA pre-szakaszában egy aminosav csendes pozíciójában eredményez változást (CTG-CTA). 19
