201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
35 HU 201115 n 36 A pJDB207/PHO5-TPA(lA) és pJDB207/Pll05- TPAü plazmidok konstruálása 12-15. ábrák A PH05 promoterL és a PH05 szignálszakaszt leolvasási fázisban az érett TPA-t kódoló szakaszhoz kapcsoljuk. P1I05 transzkripciós terminációs jel is található a konstrukcióban. a) Az M13 mp 9/PI105 Bam-Sal molekula konstrukciója (lásd 12. ábra) 2 pg pBR322/PW05 BamSal plazmidot (lásd 1. ábra) hasítunk Bamlll és Sail restrikciós endonukleázokkal (mindkettő Biolabs) a szállító által előírt körülmények között. így kapjuk a P1105 promoterL tartalmazó (3a. példa, 3a. ábra) 623 bp méretű Bamlll-Sall fragmented Az M13 mp 9 egyszálú fágvektor (23) replikatív formájából (RF) 2 pg-ot emésztünk ugyanezekkel az enzimekkel. Mindkét DNS-kószítményt 0,6%-os lágy agaróz gélre viszszük az 5. példában leirt módon. A pBR322/ PH05 BamSal plazmidból származó 623 bp méretű fragmentet és az M13 mp 9-ből származó 7,2 kb méretű fragmentet az 5c. példában leírt módon extraháljuk a gélből. Mind a 623 bp méretű fragmentből, mind a 7,2 kb méretű M13 mp 9 DNS fragmentből 150-150 ng-ot ligálunk 200 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) 4 órán át 15 °C-on 60 mM TRIS-HC1 (pH7,5) 10 mM magnézium-klorid, 10 mM DTT és 1 mM ATP összetételű oldatban. A JM 101 E. coli törzset Messing módszerével (23) transzformáljuk, majd 12 fehér plakkot izolálunk és az RF plazmid (38) restrikciós elemzésével vizsgáljuk. Az összes vizsgált klón tartalmazza a 623 bp méretű fragmentet az M13 mp 9 Bam-Sal helyére beépítve. Egy izolátumot kiválasztunk és ezt M13 mp 9/P1105 Bam-Sal jelzéssel látjuk el. (lásd 12. ábra). b) A TPA fehérjét kódoló szakasz hozzákapcsolása a PH05 szignál-szakaszhoz (lásd 12. ábra) 2 jug pW349 F plazmidot (lásd 7. péda) Bglll endonukleázzal emésztünk (New England Biolabs) a szállító által megadott körülmények között. A DNS-t elanoilal kicsapjuk, majd 6 mM Tris-lICl (pH 7,5) 50 mM nátrium-klorid, 6 mM magnézium-klorid összetételű pufferban szuszpendáljuk. A DNS 3’ beugró végét az E. coli DNS-polimeráz Klenow fragmentjével feltöltjük. A reakciót 50 pl össztérfogatban 2 egység enzimmel hajtjuk végre 80 pM dATP, dGTP, dCTP és dTTP jelenlétében 37 °C-on, 30 percig. Az inkubálást fenol-extrakcióval állítjuk le, majd a DNS-t etanollal kicsapjuk. 2 pg M13 mp9/PH05 Bam-Sal RF plazmidot KprI (Biolabs) restrikciós endonukleázzal 8. Példa 20 emésztünk a szállító által megadott módon. A DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 10 pl, 200 mM nátrium-klorid, 1 mM cink-szulfát és 60 mM Na-acetát (pil4,6) összetételű pufferban oldjuk. Egy egység Sí exonukleázt aduk hozzá, és az elegyet. 60 percig 37 °C-on inkubáljuk. A reakciót fenoios ext.rakcióval állítjuk le, a DNS-t etanollal kicsapjuk és 50 pl, 50 mM Tris-lICl (pH7,5), 1 mM magnézium-klorid öszszetételű pufferban oldjuk. 10 egység borjú-ból alkalikus foszufatázt (Boehringer) adunk hozzá és a reakcióelegyet 60 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd 65 °C-on újabb 60 percig. A DNS-t DE52 (Whatman) ioncserélő kroma- Lográfiával (lásd 9a. példa) tisztítjuk, majd etanollal kicsapjuk. 1,5 pg Bglll-vei emésztett pW349F plazmidot a fentiek szerint Klenow DNS polimerázzal kezeljük, és 0,5 pg KprI-gyel hasított, Si-gyel emésztett és foszfatázzal kezelt M13 mp9/PH05 Bam-Sal fraginentlal ligáijuk 10 pl össztérfogatba 900 egység T4 DNS ligázzal a fentiekben leírt pufferban azzal a különbséggel, hogy 4 mM ATP-t használunk és az inkubálást 18 órán át szobahőmérsékleten végezzük. E. coli JM 101 sejteket transzformálunk, 6 fehér plakkot kiválasztunk és az egyszálú fág-templátot a leírás szerint (38) izoláljuk. A kapcsolódási hely nukleotid sorrendjét (a 2,0 kb méretű Bglll fragment és az M13 mp 9 vektor kapcsolódása) a didezoxi lánc-terminációs módszerrel (39) határozzuk meg. A következő oligo-dezoxinukleotid prímért használjuk. 5 ’ AGTATGUCTTUATCTCTC 3’ Az oligo dezoxinukleotidot a foszfotriészter módszerrel (40,41) szintetizáljuk. Ez a P1105 promol.eren belül hibridizálódik, és lehetővé teszi az elongóciót a kívánt DNS kapcsolódási ponton keresztül az E. coli DNS polimeráz Klenow fragmentjével. Egy megfelelő izolátumot kapunk, mely a következő DNS nukleotid-sorrenddel rendelkezik (a PH05 fehérjét kódoló szakasz ATG triplettjétől indul): A TG TTT AAA TCT GTT GTT TAT TG A ATT T'l'A GCC GCT TÜT" T'l'G GCC AAT GCA GGA TCT TAG CAA GTG ’--------- PH05 fehéréi kódoló szakasz — TPA fehérjét kódoló szakasz Ezt a konstrukciót M13 mpO/W/Oó-TPA-nak nevezzük (lásd 12. ábra) c) Rövidített PII05 transzkripciós terminációs fragment előállítása (lásd 13. ábra) 10 pg p3lR plazmid DNS-t (lásd 7. ábra) emésztünk Smal restrikciós enzimmel, a DNS-l fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A DNS-t 0,5 mg/ml koncentrációban 10 mM Tris-HCl (pll8,0) pufferban oldjuk. 10 pg Saml-gyel hasított DNS-t 2 egység Bal31 exonukleázzal (BRL) emésztünk 100 pl, 20 mM TR1S-HC1 (pH8,0) 100 mM nátrium-klo-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
