201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
31 HU 201115 B 32 A TPA gén előállítása a) Az mRNS előállítása 175 cm^es Falcon sejttenyésztő-lombikokat oltunk 10x10® Hela sejttel, majd 25 ml Dulbecco féle módosított Eagle táptalajban (DME) tartjuk, melyet 5% borjúmagzat-szérummal egészítünk ki. A táptalajt három naponként cseréljük, míg a sejtek egybefüggő réteget nem képeznek. Az összefolyó egyrétegű sejttenyészetet kétszer mossuk PBS-sel (foszfáttal pufferolt sóoldat: 80 g nátrium-klorid, 2 g kélium-klorid, 14,4 g dinótrium-hidrogén-foszfát és 2 g kálium-dihidrogén-foszfát egy liter oldatban), majd ezt követően 16 órán át 100 ng/ml TPA-val kiegészített DME oldatban tartjuk. Az össz-RNS-t extraháljuk (27) közvetlenül az egysejtes rétegre vitt feltáró pufferrel. Az össz-RNS-ból a poli (A)-ban gazdag szakaszokat Nagamine és munkatársai (28) módszerével izoláljuk. A szacharóz-gradiens ultraeent.rifugálást SW-41 rotorral, Beckman ultracentrifugában végezzük. 100 pg poli (A) RNS 200 pl vizes oldatát 15-30%-os szacharóz gradiensen centrifugáljuk. 0,02 M TRIS.HC1 (pll7.4) 0,1% SDS, 0,01 M EDTA, 0,04 M nátrium-klorid összetételű oldatban 30 000/perc fordulatszámmal, 18 °C-on 12 órán át. A gradienst az aljától kezdve 36 frakcióban vesszük le, az RNS-t 0,2 M nátrium-kloriddal és 2,5 térfogat etanollal csapjuk ki. Éjszakén át -20 °C-on tartjuk, majd az RNS-t centrifugálással kinyerjük és 20 pl vízben oldjuk. Vizuális megfigyelés alapján hatodik fázisban lévő oocytékat választunk ki, módosított Barth féle táptalajban tartjuk és a szacharóz-gradiens frakciókból származó RNS-el oltjuk be, lényegében a (29)-ben leírt módon. Az injekciózott oocyták plazminogén-aktivótor kiválasztását a Nagamine és munkatársai (28) által leírt radiális kazeinolízissel mutatjuk ki. Maximális TPA kiválasztást a 21-23S frakciókkal injekciózott oocytáknál látható, b) cDNS szintézis és molekuláris klónozás A TPA mRNS-ben dúsított Hela Poli (A) RNS-röl cDNS másolatot készítünk. 8 pg 50 mM TRIS.HC1 (pH8,3) 75 mM kálium-klorid, 8 mM magnézium-klorid, 1 tf% etanol, 0,2 mM EDTA, 25 pg/ml o)igo dT12-18, 0,5 mM mindegyik dNTP-ből és 12 pCi (c(32P) dCTP (New England Nuclear). Az oldatot 0 °C-ra hütjük és 3 mM nátrium-pirofoszféLot, 1 mM DTT-t és 144 egység reverz transzkriptázt (Life Sciences Ltd) adunk hozzá. 60 percig 39 °C-on tartjuk, majd újabb 32 egység reverz transzkriptázt adunk hozzá. 100 perc inkubálás után a reakciót 0,2% SDS és 15 mM 7. Példa EDTA (végkoncentráció) hozzáadásával állítjuk be. Az (oC32P) dCTP beépülését a cDNS-be a reakció-elegy alikvot részének Lriklór-ecetsavas kicsapésával vizsgáljuk. 1,15 pg cDNS szintctizálódik 8 pg RNS-ről (14,4% másolat). Kloroform-izoamil-alkohol eleggyel (24:1 v/v) való kétszeri extrahálós után a vizes fázist sómentesitjük, 4 ml (5x0,5 cm) Sephadex G50 (finom) oszlopon való átcentrifugálással 20 mM TR1S.HC1 (P119), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA oldatban. Az üres térfogat frakcióit egyesítjük, és nátrium-hidroxidot adunk hozzá, 0,3 N végkoncentrációban. 1,2 órán át 20 °C-on tartjuk, utána 0,3 N végkoncentrációban sósavat adunk hozzá és a nukleinsavat 3 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk. A második lánc szintézisét 200 pl, 200 MM N-(2-hidroxietil)-piperazin-N’-etón-2- -szulfonsav (liepes) (pH6,9), 30 mM kólium-klorid, 10 mM DTT, 10 mM magnézium-klorid, 0,5 mM dATP, dCTP, dTTP és mikrogramm cDNS-enkónt 25 egység Klenow-fragment öszszetételü oldatban végezzük. Két óra 25 °C-os inkubálás után a reakciót az SDS koncentrációjának 0,1%-ra állításával leállítjuk, majd az oldatot sómentesitjük 4 ml-es Sephadex G50 (finom) oszlopon való átcentrifugálással, 30 mM nátrium-acetát (pH4,5), 0,2 mNaCl, 3 mM Z11CI2, 0,1% SDS összetételű oldatban. Az üres-térfogat frakciókhoz 2,5 egység/inl SÍ nukleázt adunk és az oldatot 30 percig inkubéljuk 37 °C-on, Az oldatot fenol-kloroform-izoamilalkohol (24:24:1 v/v) eleggyel extraháljuk, majd a vizes fázisban lévő nukleinsavat 0,3 M végkoncentróciójú nátrium-kloriddal és 3 térfogat etanollal kicsapjuk. Az első szálba beépült (uC 32P) dCTP 76%-a triklórecetsavva) kicsapható marad az Sl-es emésztés után és alkalikus agaróz-gélen (30) való futtatással 500-3000 bp méretű kétszélú cDNS molkulákat látunk. A ds cDNS minLát méret szerint frakcionáljuk 5-20%-os szacharóz Gradiensen, 10 mM TRIS.HC1 (pH7,4), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1%-os SDS oldatban. 10 órán át centrifugáljuk 12 °C-on SW 41 rotorban 39 000/perc fordulatszámmal, majd a legnagyobb méretű cDNS-t tartalmazó frakciókat (az összminta 43%-a) egyesítjük és 0,3 M végkoncetréciójú nátrium-klorid, 5 pg/ml BSA és 3 térfogat etanol hozzáadáséval kicsapjuk. 25 pg méret szerint szétválasztott cDNS végére dC egységeket kötünk (31) szerint 85 pl, 450 egység/ml terminális transzferózt., 0,1 M kálium-kakodilátot (pH7,5), 2 mM kobalt-kloridot, 1 mM EDTA-t, 0,1 mM DTT-t és 5 pM (cí32P) CTP-t (20 pCi) tartalmazó reakeióelegyben. 3 percig tartjuk az elegyet 30 °C-on, majd a reakciót 10 mM EDTA 0,2% SDS és 100 pg/ml tRNS (mindhárom végkoncentráció) hozzáadásával leállítjuk. Az oldatot kétszer extraháljuk kloroform-izoamilakohol eleggyel, majd 5 ml-es Sephadex G50 (finom) oszlopon sómentesitjük 20 mM Tris.HCl (PH9), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA oldatban. Az üres térfogat frakcióit 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 18
