201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
21 22 HU 201 LI5 U következő lépést jégen végezzük: 0,3 ml lizozim oldatot (10 mg/ml, 11000 U/mg, Worthington) adunk hozzá, 5 perc múlva 1,2 ml EDTA-t (500 mM, pH 8,0), majd újahb 5 percelteltével 4,8 ml detergenst /0,1% Triton X-100 (Merck), 50 mM EDTA, 50 inM TR1S.11C1 pH 8.0/ adunk hozzá. 5 perc elteltével a lizátumot előhűtött SS 34 rotorban centrifugáljuk 40 percig 4 °C-on. A felülúszót óvatosan eltávolítjuk és szilárd CsCl-t adunk hozzá (8,3 g CsCl-t 8,7 ml felülúszóhoz). 1 mg/ml felülúszó végkoncentrációjú etidium-bromid (Sigma) hozzáadása után az oldatot 13,5 ml-es Quick Seal poliallomer csövekbe (Beckman) tesszük és Beckman Ti50 rotorban 40 órán át 40 000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. Hosszúhullámé UV fény (366 nm) hatására két fluoreszcens esik látható. Az alsó esik tartalmazza a nativ (supercoiled) plazmid DNS-t, és oldalról, a csövet 18 G-S tűvel megszúrva, 2 ml-es fecskendővel távolitjuk el. Az etidium-bromidot úgy tóvolítjuk el, hogy az oldatot ötször extraháljuk CsCl-dal telített izopropanollal, majd a kapott színtelen oldatot 30 ml-es Corex csövekbe tesszük. 2,5 térfogat TE puffert adunk hozzá és a DNS-t etanollal kicsapjuk. Az oldatot ezután 12-15 órán át -20 °C-on tartjuk. A kicsapott DNS-t Sorvall HB-4-es rotorban 30 percig 12 000/perc fordulatszámmal 0 °C-on centrifugáljuk, majd 200 pl TE-ben oldjuk. 50-100 pg hibrid DNS-t nyerünk ki 100 ml tenyészetből. A fenti sejtkeverékből izolált plazmid DNS-sel Saccharomyces cerevisiae AH216 törzset (a, Ilis+, leu2, ph03 ph05) transzformálunk a Hinnen és munkatársai által közölt módszerrel (12). A transzformált élesztősejteket alacsony szervetlen foszfát tartalmú táptalajra replikázzuk (azaz .Difco élesztő minimál táptalaj aminosavak nélkül", kiegészítve 20 g/1 glükózzal, de a Difco recept alapján (Difco Mannal, Difco Laboratories, Detroit USA) komponensekből összeállítva, azzal a különbséggel, hogy 1 g/1 kálium-dihidrogén-foszfót helyett 0,03 g/1 kálium-dihidrogén-foszfátot és 1 g/1 kálium-kloridot hasz-^ nálunk), a savas foszfatáz aktivitás meghatározása céljából megfestjük, színezék agarral (IX Difco agar 100 mM, pH 4,0 acetát pufferban, 2 mg/ml Fast Blue B salt (Serva) és 0,2 mg/ml alfa-naftil-foszfát (Serva) rétegezve a sejteket. Működőképes PHOS génnel rendelkező telepek megvörösödnek a gén alacsony Pi-tartalmú táptalajon való derepreszsziója miatt. A génbank ismételt csoportokra bontáséval 3, egymástól független represzszálható savas foszfatáz aktivitással rendelkező kiónt kaptunk. Az egyik ilyen kiónt (pG7) alaposabban megvizsgáltuk. A hibrid-plazmid mérete 42 kb. A pG7 EcoRI és BamlII fragmenteit pBH322/HIS3-ban (13) és pJDB207-ben (22) szubklónozzuk. A restrikciós emésztéseket az enzimek előállítója (New England Biolabs) által javasolt körülmények között végezzük, a lígálást 20 pl őssztérfogatban 150 egység T4 DNS-ligázzal (New England Biolabs) és az emésztett plazmiddal 20 pl/ml koncentráció- 5 ban végezzük a (New England Biolabs által ajánlott körülmények között.) A 8 kb méretű EcoRI fragment 5,1 kb méretű BamHI fragmentjét pJDD207 élesztővektorban szubklónozzuk, majd AH216 élesztötörzsbe transzfor- 10 múlva ez a hibrid-plazmid (pJDB207/PHOS, PII03, lásd 1. ábra) derepresszáló körülmények között (alacsony szervetlen foszfát koncentráció) nagy foszfatáz aktivitást mutat (pHOS gén), normál élesztő táptalajon ala- 15 csony aktivitást mutat (a PII03 gén megnyilvánulása). 3. Példa 20 A PII05 és PII03 gének lokalizálása és DNS szekvencia-analízise a) A PH05 gén 25 A PII03 és PH05 géneknek a BamHI fragmenten való lokalizálásánál kihasználjuk a Sau3A restrikciós helyeket és az egyetlen PstI helyet. A BamHI fragmentet Sau3A rest- 30 rikciós endonukleázzal emésztve (New England Biolabs) 6 fragmentet kapunk (A-F, 2. ábra). A részleges Sau3A emésztéssel kapott fragmenteket az önállóan replikálódó pJDB207 élesztővektor BamHI helyére szubklónozva a 35 Sau3a fragmentek különböző kombinációit tartalmazó plazmidokat kapunk. Ezeket a plazmidokat használjuk a Saccharomyces cerevisiae AH216 élesztő pho3, pho5 mutánsainak transzformálására. A transzformánsok 40 savas foszfatáz aktivitását alacsony foszfát-tartalmú vagy normálminimál táptalajon való növesztés után vizsgáljuk. A Sau3A fragmentek közül a legalább A-t és B-t tartalmazó kiónok (2. ábra, 1-4.) ugyanolyan mennyiség- 45 ben termelnek savas foszfatázt (kvalitatív becslés alapján, savas foszfatáz festö-agarral felülrétegezve, a 2. példában leírt módon) mint az egész 5,1 kb méretű BamHI fragment. A kifejeződést normális körülmények között a 50 táptalajban lévő szervetlen foszfát-koncentrációja szabályozza. A csak az A Sau3A fragmentet tartalmazó kiónok [(2. ábra), 5., 6.] alacsony szinten termelik a savas foszfatázt, és ezt nem befolyásolja a táptalajban levő 55 szervetlen foszfát koncentrációja. Ez azt mu. tatja, hogy az A Sau3A fragmenten lévő információ a konstitutív savas foszfatáz (PH03) kifejeződéséhez elegendő. A Sau3A D fragmentről egyedül (2. ábra, 7.) nem fejeződik 60 ki savas foszfatáz sem represszólt, sem derepresszált. körülmények között. Azonban a BamHI és PstI hasítási helyek közötti teljes szakaszt tartalmazó szubklón (2. ábra, 10.) szabályozott, nem konstitutív savas foszfatáz 65 szintézist, mutat. Teliét ez a szubklón tartalmazza az élesztő PH05 gént (13). 13
