201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
23 HU 201115 U A PII05 gén pontos helyét DNS szekvenálással, Maxam és Gilbert módszerét (10) alkalmazva határozzuk meg. Egy 623 bázispár méretű Bamlll-Sall restrikciós f ragmen tét klónozunk a pBR322 plazmidba (lásd 1. ábra), a 375-650. bázisok közötti Bamlll-Sall fragmentet (pBR322 nomenklatúra) helyettesítve vele a fentiekben leírt emésztési és ligálási körülmények között (minden enzim a New England Biolabs-tól van) A Bamlll-Sall DNS-szakasz fragmentjeit a következő helyeken: BamllI (-541), Sau3A (-200) és Sáli (+82) (a számozáshoz lásd a 3a. ábrát) aszimmetrikusan jelöljük az 5' végeken. A 623 bp méretű Bamlll-Sall DNS-szakasz nukleotid-sorrendjét a 3a. ábrán mutatjuk be. Ez azt mutatja, hogy a beépített DNS-szakasz a PII05 promoter-régiót és a PH05 foszfatáz fehérjét kódoló régió egy részét tartalmazza. b) A PH03 gén A PH03 gén pontos helyét DNS bázissorrend-analízissel határozzuk meg a New England Biolabs által kiadott „M13 cloning and DNA sequencing system" cimü kiadvány alapján. Egy 415 bp méretű (5’) Pstl-Rsal (3') fragmentet szubklónozunk az M13 mp8 M13 mp9 vektorban, az egyedülálló Pst.I és SamI restrikciós helyek felhasználásával. A 416 bp méretű Pstl-Rsal DNS-szakasz nukleotid-sorrendje a 3b. ábrán látható. Ez azt mutatja, hogy a szakasz tartalmazza a PH03 promoter-régiót és PH03 savas foszfatáz fehérje kódoló szakaszának egy részét. 4. Példa A p30 plazmid készítése (lásd 4. ábra) a) A Dali restrikciós liasitási hely eliminálása a pBR322 plazmidból 3 pg pBR322 plazmidot teljesen megemésztünk a Ball (BRL) és PvuII (Biolabs) restrikciós enzimekkel, az elöállitók előírásai szerint. A pBR322 plazmid BalI/PvuII kettős emésztésével két, 3738 bp és 622 bp méretű restrikciós fragmentet kapunk. A két fragmentet 1%-os, alacsony olvadáspontú agaróz gélen választjuk el (Sigma) TBE (90 mM Tris.HCl, pH8,3, 2,5 rnM EDTA, 90 mM bórsav) pufferben. A DNS sávokat etidium-bromiddal festjük, majd hosszú hullámhosszú (366 nrn) UV fénnyel láthatóvá tesszük. A 3738 bp méretű fragmentet tartalmazó agaróz-darabokat kivágjuk a gélből, 65 °C-on megolvasztjuk, a natrium-klorid koncentrációt 500 mM-ra állítjuk és 20 percig 65 °C-on tartjuk. Egy térfogat fenolt (10 mM TR1S.HC1 pll7,5, 1 mM EDTA, 500 nM náLrium-klorid összetételű pufferral telítjük előtte) adunk hozzá. A vizes fázist kétszer extraháljuk fenollal, egyszer 14 kloroformmal. A DNS-t 2,5 térfogat hideg abszolút etanollul kicsapjuk, majd centrifugálással kinyerjük. A DNS üledéket hideg 80%-os etanoilal mossuk, majd vákuumban szárítjuk. A DNS-t TE pufferban oldjuk 0,15 mg/ml koncentrációban. Az izolált 3738 bp méretű DNS fragmentnek a Ball és PvuII kettős emÓBzLés miatt két tompa vége van. A DNS-t tompa-vég ligólással körré zárjuk. 0,6 pg DNS-t inkubálunk éjszakán át szobahőmérsékleten 30 pl 60 mM Tris.HCl pH7,5, 10 mM magnézium-klorid 10 mM ATP összetételű pufferban 900 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs). A 1 i géló elegyből 5 mikroliteres részeket adunk 50 mikroliter, kalciummal kezelt, transzformációra alkalmas Escherichia coli HB 101 sejtekhez, melyeket Mandel és munkatársai (24) módszerével állítottunk elő. A keveréket 5 percig jégen tartjuk, majd 2 percig 37 °C-on inkubáljuk, és 10 percig szobahőmérsékleten hagyjuk mielőtt 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB agarlemezekre szélesztjük. Hat arap* telepet izolálunk és külön növesztünk 100 ml LB (összetétel ugyanaz mint az előbbiekben, agar nélkül) táptalajon. A sejtekből a 2. példában leírt módon izolálunk plazmid DNS-t. A HaellI (szállító Biolabs, emésztési körülmények az előállító szerint), PvuII és Ball restrikciós enzimekkel való emésztés utón kapott fragmenteket 1,5%-os agaróz gélen, TBE pufferban elemezzük. Az újonnan összekapcsolt fragmentek restrikciós mintázata és előre megadott mérete azt mutatja, hogy a plazmidok azonosak és a Ball-PvuII fragment kivételével azonosak a pBR322 plazmiddal. Ezekből a plazmidokból hiányzik a Ball restrikciós hely, jelölésük pBR322a Ball. b) A P1Í03 és PH05 géneket tartalmazó élesztő 5,1 kb méretű BamllI restrikciós fragment klónozása pBR322á Dali plazmidban A pJDl) 207/PH05, PH03 plazmid tartalmazza (lásd 1. ábra) a szabályozott és konstitutív élesztő savas foszfatáz (P1I05 és PH03) géneket hordozó élesztő 5,1 kb BamllI fragmentet. A pJDB 207/PROS, PI103 valamint a pBR322a Ball plazmidot BamllI restrikciós enzimmel emésztjük. A teljes emésztés lejátszódása után az enzimet 2 percig 65 °C-on tartva inaktiváljuk. Mindkét DNS-t kicsapjuk etanoilal, majd mindegyiket 0,2 mg/ml koncentrációban 10 mM TRIS.HCl pH 8,0 pufferban oldjuk. Mindegyik Bamlil-gyel emésztett DNS-ből 0,5 pg-ot 20 pl össztérfogatú ligáló pufferban elkeverünk (a New England Biolabs előírásai szerint) és 300 egység T4 DNS ligázzal inkubáljuk 20 órán át 15 "C-on. A ligáló elegyből 5 pl-es alikvol részeket adunk 50 pl kalciummal kezelt Escherichia coli sejtekhez, és a transzformációt a 4a példában leírt módon hajtjuk végre. A transzformált sejteknek megvizsgáljuk ampicillin 24 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
