201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
19 HU 201115 8 20 A 18. ábrán a p31/PH05-TPA18 plazmid készítését látjuk. A 19. ábrán a PH05 szignálszakasz és az érett TPA-t kódoló szakasz összekapcsolódását látjuk a p31/PH05-TPA18 plazraidban. 5 A 20. ábrán a prepro-TPA szakasz részeit tartalmazó DNS fragmentek izolálásának sematikus vázlatát látjuk. A 21. ábrán a p31R/SS-TPAa 2 plazmid készítését látjuk. 10 A 22. ábrán a pBR322/PH05 Bam-Rsa637 közbenső plazmid készítését látjuk. A 23. ábrán olyan plazmidok készítését látjuk, melyekben a PH05 szignálszakasz belenyúlik a PH05 kódoló szakaszba. 15 A 24. ábrán a PH05 promotereknek és a PH05 kódoló szakasz egy részének az érett TPA-t kódoló szakaszhoz való kapcsolódását látjuk az A, B vagy C linkeren keresztül. A 25. ábrán a PH05 génnek a TPA gén 20 -nel való kromoszómális helyettesítését mutatja. A 26. ábra: az A ábrához (SDS-PAGE): 1. és 4. csík: standard fehérjék (molekulatö- 25 meg-markerek) 2. és 5. csík: melanoma TPA 3. és 6. csík: élesztő TPA az 1-3. csíkok redukáló körülmények között a 4-6 csíkok nem-redukáló körülmények kö- 30 zött A mintákat 12,5%-os gélen futtatjuk, a fehérjét Coomassie Brillant Blue-val festjük; a B ábrához (aktivitás-gél, lásd 23. példa): 1. csík: melanoma TPA 35 2. esik: élesztő TPA Kazein-agar-plazniinogén felülrétegzés (56). A következő példák a jelen találmány illusztrálását szolgálják, nem tekinthetők a találmány korlátozásának. 40 Kísérleti rész A példákban a következő rövidítéseket használjuk: BSA: DTT: EDTA: SDS: TNE: 10 szarvasmarha szérum-albumin 45 1,4-ditiotreitol (1,4-dimerkapto-2,3-butándiol) etiléndiamin-tetraecetsav nátrium-dodecil-szulfát 100 mM nátrium-kloridot, 50 10 mM TRIS-HCl-t (pH 7,5) és 1 mM EDTA-t tartalmazó oldat TE: TRIS-HC1: MOPS 10 mM TRIS-HCl-t (pH 7,5) és 1 mM EDTA-t tartalmazó 55 oldat tris-(hidroximetil)-amino-metán, pH állítás sósavval 3-morfolin-propán-l-szulfonsav, 60 65 1. Példa Élesztő génbank előállítása Saccharomyces cerevisiae S288C törzsből származó nagy molekulasúlyú DNS-ból (17) 30 mikrogrammot 30 percig 37 °C-on inkubálunk, 2 egység EcoRI metilázzal (New England Biolabs) 250 /ul, a szállító által javasolt EcoRI metilezéssel pufferban. A DNS-t kicsapjuk etanollal, 500 mikroliter 25 mM-os TRIS.HC1 (pH 8,5), 2 mM MgCh oldatban (EcoRi* puffer) (18) szuszpendáljuk, majd addig emésztjük EcoRI enzimmel (Boehringer), míg a DNS fragmentek méreteloszlásának maximuma a 30-50 kb tartományban lesz (a lambda DNS-t Xhol-gyel emésztve a fragmentek mérete 33 kb és 17 kb). Az EcoRI* körülmények között emésztett élesztő DNS-t szacharóz gradiensen (5-20%-os szacharóz 10 mM TRIS.HC1 pH 7,5, 1 mM EDTA oldatban) frakcionáljuk, 6 órán át 38000/perc fordulatszámmal centrifugálva SW40 rotorban. A gradiens tetejéről 30 0,4 ml-es frakciót szedünk. A 16-os frakció tartalmazza a 30-40 kb méretű DNS fragmenteket. Az ebben a frakcióban levő DNS-t (3 Mg) etanollal kicsapjuk, majd 16 órán át 15 °C-on, 15 ul össztérfogatban 1 Mg, EcoRI-gyel linearizált pYcl kozmid-vektorba (19) ligáljuk. A ligálást 300 egység T4DNS ligázzal (New England Biolabs) hajtjuk végre, a szállító által leirt pufferrendszerben. A DNS-t in vitro lambda fágba pakoljuk (20) és a kapott fágokat használjuk Escherichia coli HB101 törzs [i'k, nrn, leír, prer, recA~) transzdukálására. A transzkdukálás hatásfoka körülbelül 5000 ampicillin rezisztens telep per mikrogramm pYcl vektor. 3000 amp® telepet izolálunk és növesztünk külón-külön mikrotiter lemezek lukaiban olyan LB táptalajban /10 g Bacto-Tryptone (Difco), 5 g Bacto Yeast Extract (Difco), NaCl/, mely 100 mg/ml ampicíllint tartalmaz. 2. Példa A szabályozott savas foszfatázgén, PH05 izolálása A génbank telepeit 100 ug/ml ampicíllint tartalmazó LB agarlemezekre (LB táptalaj plusz 15 g/1 agar) replikázva növesztjük. 500 telepből származó sejttömeget összemosunk. Az egyes sejtkeverékekból a következő módszerrel izoláljuk a DNS-t. A sejteket centrifugálással ülepítjük (Sorvall, GSA rotor, 10 perc, 6000/perc fordulatszám, 4 °C), 100 ml TE-ben (10 mM TRIS.HCI, 1 mM EDTA, pH 8,0) szuszpendáljuk, majd a fenti körülmények között újra centrifugáljuk. A sejtmasszát 3 ml Tsuc oldatban /50 mM TRIS.HCI, pH 7,5 25 v% szacharóz/ szuszpendáljuk majd SS-34 polipropilén Sorvall csövekbe tesszük. Az összes 12
