201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
1 2 IIU 201115 B A találmány tárgya eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel, a rekombináns DNS technológia felhasználásával. Pontosabban a találmány tárgya eljárás olyan szöveti plazminogén aktivátort kódoló DNS 5 szakaszt tartalmazó élesztő hibrid-vektor előállítására, melyben a kódoló szakasz a kifejeződését befolyásoló promoter-rendszerhez kapcsolódik, az említett hibrid vektorral transzformált, vagy a szöveti plazminogén 10 aktívától' génjét kromoszómába integrált formában tartalmazó élesztösejtek előállítására, valamint új szöveti plazminogén aktivátorok előállítására. A fejlett országokban a megbetegedések 15 és halálozások fő okozói a vérrögök. A vérrögök fibrinből állnak, mely a trombin enzim hatására keletkezik oldódó prekurzorából, a fibrinogénból. Számos enzim és egyéb anyag biztosítja, hogy a vérrögök normális körül- 20 mények között csak akkor és ott keletkeznek, ahol a vérveszteség megakadályozása céljából szükség van rájuk. Az emlősök vérplazmája olyan enzimrendszert tartalmaz, mely képes feloldani a 25 fibrint a vérrögökben. A fibrinolitikus rendszer egyik komponense egy enzimcsoport, a plazminogén aktivátorok, melyek a plazminogént (a plazmin inaktiv proenzim formáját) a proteolitikus enzimmé, plazminná alakítják. A 30 plazmin ezután oldható termékek keletkezése közben lebontja a rögök fibrin-vázát. Azokban az esetekben, mikor a szervezet trombolitikus aktivitása nem elegendő a keletkezett intravaszkuláris trombuszok eltávolítására, 35 például trombo-embolizmusban vagy operáció utáni komplikációban szenvedő betegeknél, elkerúlheLel.len külső trombolitikus anyagok alkalmazása. Trombolitikus terápia céljaira a humán 40 plazminogén két aktivátora kapható kereskedelmi forgalomban az urokináz, emberi vizeletből vagy tenyésztett vesesejtekből izolált szerin-protáz, és a sztreptokináz, egy sztreplokokkuszokból előállítható baktérium- 45 fehérje. Mivel egyik enzimnek sincs specifikus affinitása a fibrinhez, az ezekkel az anyagokkal végzett trombolizis együtt jár a plazminogén általános aktiválásával, melynek eredménye a koagulációs fehérjék megkülön- 50 böztel.és nélküli emésztése, ezáltal lényegesen megnő a belső vérzés veszélye a kezelés során. Továbbá a sztreptokináz az emberi szervezet számára idegen fehérje, ennélfogva indukálja a működését leállító, semlegesítő 55 antitestek képződését és ártalmas, potenciálisan halálos allergiás reakciókhoz vezet. A plazminogén aktivátorok másik csoportja, a szöveti plazminogén aktivátorok (ezentúl .TPA'-ként hivatkozunk rájuk) is 60 ismertek a legtöbb emberi szövetben. A különböző szövetekből származó TPA-k molekuláris tulajdonságaikat tekintve valószinüleg különböznek egymástól, de immunológiailag hasonlók. Különböznek az urokináztól kémiai 65 és immunológiai tulajdonságaik alapján, a fibrin jelenlétében nagymértékben megnövekedett fibrinolitikus hatásuk alapján, valamint a fibrinhez való nagy affinitásuk alapján [(1), (2)1. A fibrinhez való nagy affinitásuk miatt a TPA-k csak a vérrög szomszédságában működnek, ezáltal lényegesen csökken az ellenőrizetlen vérzés veszélye. A TPA két molekuláris formában létezik: az aktiv kétláncos formában (TPA) valamint az inaktiv egyláncos formában [TPA-prekurzor vagy .pro-TPA" ezentúl, lásd (2), (3), (4)]. A pro-TPA-t aktiv TPA-vá alakíthatjuk katalitikus mennyiségű plazminnal inkubálva, előnyösen fibrin jelenlétében. A plazmin tehát saját szintézisét indítja be. A humán TPA forrása például a különböző emberi szövetek extraktuma (nem használhatók kereskedelmi célokra) valamint különböző olyan emberi daganatsejtek, melyekről kimutatták, hogy különböző mennyiségben TPA-kat termelnek [(5), (6)). Egy újabban benyújtott szabadalmi bejelentésben (EP 41766, feltatlálók D. Collen, D.C. Rijken és 0. Matsuo) egy 72 000 Dalton molekulasúlyú TPA-t írnak le, melyet tenyésztett humán melanoma sejtvonalból (Rowes) izoláltak. Azonban a Lranszformált, rákos sejtvonalak (mint a melanoinasejtek) használata szükségszerűen korlátozza az innen izolált TPA-k alkalmazását a gyógyászatban. Továbbá bebizonyosodott, hogy nehéz emlőssejteket nagy térfogatban tenyészteni, ami pedig előfeltétele annak, hogy az ilyen sejtek által kiválasztott fehérjéket olcsón és gazdaságosan állítsuk elő. Az emlőssejtek generációs ideje lényegesen magasabb, mint a mikroroganizmusoké, ezért megfelelő nagy sejtsürüség elérése hosszabb fermentációs időt igényel. Viszont az emlőssejtek növesztésével elérhető sejtsürűség lényegesen alacsonyabb annál, mint amit mikroorganizmusok nagy térfogatban való tenyésztése során általában elérnek. Ezenkívül a mikroorganizmusokhoz viszonyítva a törzsfejlesztés is nehéz. Ennélfogva előnyösnek tűnik a TPA előállítása mikroorganizmusokkal, felhasználva az ipari mikrobiológia jólfejlett technológiáját és az újabb fejlődést rekombináns DNS technológiában. Éppen mostanában, humán melanoma sejtvonalból származó, humán szöveti típusú plazminogén aktivátort kódoló cDNS-t klónoztak és fejeztek ki Eschericia. coli-ban [(7), (8)1. Egy estben (7), a keletkezett polipeptidról kimutatták, hogy az autentikus humán TPA-ra jellemző fibrinolitikus aktivitással rendelkezik. Azonban szenyezésként gyakran endotoxinokat találnak E. coli-ból származó fehérjekészítményekben. Egy hasznos gyógyászati termékből ezeket drága tisztítási lépésekkel kell eltávolítani. 3
