201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
3 4 Mivel az összes eukariótában közös a genetikai információ kifejeződésének mechanizmusa, ezért az eukarióta gének kifejeződése nagyobb hatásfokkal mehet végbe, egy eukarióta gazdaszervezetben mint E. coliban. 5 Az alkalmazható eukarióta szervezetek közül az élesztőt legkönnyebb kezelni. Az élesztő kiválasztási módja hasonlít a magasabb állati sejtekére és ismert, hogy az élesztósejtek képesek megváltoztatni a fehérjéket a szig- 40 nál-szekvencia (egy fehérje töltetlen N-terminális része, általában lehasad a kiválasztási transzport során) lehasitásával (9). Ráadásul úgy látszik, hogy egy eukarióta gazdaszervezet kiválasztási bioszintézis útjába belépő 45 és azon átjutó fehérjék hajlamosak a citoplazmában szintetizált fehérjékhez viszonyítva nagyobb mértékű harmadlagos szerkezetet létrehozni. Érdekes megjegyezni, hogy úgy látszik, prokariótákban, mint például E. coli- 20 -ban nincsenek magasabb fokú rendezettségű nagy fehérjék. A glikozilezó rendszer kapcsolatban áll a kiválasztó bioszintézis úttal. A glikozilezett fehérjékhez vezető alap lépések hasonlóak 25 minden eukarióta szervezetben és várható, hogy az élesztósejtek, az E. coli-szerű prokarióta sejtekkel szemben, képesek glikozilezett fehérjék előállítására (jóllehet az élesztő glikozilezési bioszintézis útjában néhány 30 utolsó lépés különbözik az emlős sejtekétől és ezért esetleg módosítani kell élesztőben). Mivel az élesztő egy mikroorganizmus, az élesztősejteket könnyű tenyészteni. Az egységnyi térfogatú tenyészléböl nyerhető 35 sejttömeg lényegesen magasabb élesztőnél mint E. coii-nál. Ezenkívül az élesztő viselkedése fermentáció közben jól ismert, és a nagytérfogatú fermentációs eljárások körülményeit is meghatározták. Sőt az élesztósej- 4Q tek mentesek az endotoxinoktól. Számos módszer ismert szöveti plazminogén aktivátorok elöállitására, szövettenyésztési eljárással vagy rekombináns DNS technológiával, E. coli-t használva gazdaszerve- 45 zetként. TPA élesztővel való előállításának módszerét, mely egyesíti a könnyen kezelhető és tenyészthető mikroorganizmus, valamint egy eukarióta szervezet jelenléte előnyeit, még nem írták le. A találmány célja tehát 50 ilyen eljárás biztosítása. A jelen találmány tárgya továbbá egy beépített TPA kódoló-szakaszt hatásosan kifejező élesztó-vektorrendszer előállítása. HU 20111 1. TPA kódoló-szakaszt tartalmazó hibrid-vektorok A jelen találmány tárgya eljárás egy 60 élesztópromotert, és a promoterrel szabályozott TPA kódoló szakaszt tartalmazó élesztő hibrid-vektorok előállítására. A TPA DNS, mely a jelen találmány szerint, részét képezi az élesztő hibrid-vektoroknak, humán erede- 55 tű, és bármely TPA elöállitására képes sejtből származhat. Ezek a sejtek lehetnek rákos és nem rákos eredetűek, és előnyösen egy elfogadott sejtvonalból származnak. A megfelelő sejtre példa lehet a melanómasejt, úgymint Bowes vagy Malme-sejt, fibroszarkómasejt, epidermális karcinóma, hólyag karcinóma, hipernefróma vagy liposzarkómasejt, Hela-sejt, fibroblasztok, limfociták, keratociták vagy mell epitéliális vagy embrionális vesesejtek. A jelen találmány előnyös kiviteli formájában Hela-sejteket használunk. A TPA DNS lehet kromoszómális DNS vagy cDNS. A kromoszómális TPA DNS-t a TPA gént tartalmazó génkönyvtárból izolálhatjuk, a TPA cDNS-t az mRNS úton állíthatjuk elő, a szakterületen ismert módszerekkel lehetséges a TPA-t kódoló szakasz egy részének, vagy a gén egy elmutált variánsának használata, mely azonos, vagy megváltozott proteolitikus hatást és/vagy aktiválási tulajdonságot mutat a pro-TPA-nak aktív TPA-vá való konverziója során. Ezen géntermékek közül néhány mutathat új, értékes tulajdonságokat. A jelen találmány szerinti élesztő promoterek az élesztő, pontosabban a Saccharomyces cerevisiae kromoszómális DNS-éból származnak. A TPA kifejezéséhez előnyösen nagyon jól kifejeződő élesztógén promoterét használjuk. így a TRP1 gén, az ADUI vagy ADHII gén, a savas foszfatáz (PH03 vagy PH05) gén, az izocitokróm gén promotere, vagy a glikolitikus enzimeket kódoló gének egy promotere, például az enoláz, gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogénáz (GADPH), 3-foszfoglicerát-kináz (PGK), hexokináz, piruvát dekarboxiláz, foszfo-fruktokináz, glükóz-6- -foszfát-izomeráz, 3-foszfoglicerát mutáz, piruvát-kináz, triózfoszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz és glükokináz gének promotere, vagy az a illetve alfa-faktort, az élesztő szexuális feromonjait kódoló gének promotere használható. A jelen találmány szerinti előnyös tulajdonságú vektorok transzkripciós kontroll alatt álló promotert tartalmaznak. Az ilyen típusú prometereket, például a PHOS és CAPDH gének promotereit ki- és bekapcsolhatjuk a növekedés körülményeinek változtatásával. A P1Í05 promoter például a kísérletező tetszése szerint lehet represszálva vagy derepresszálva, csupán a tápközegben levő szervetlen foszfát koncentrációjának növelésével vagy csökkentésével. így a promoter az élesztő exponenciális növekedési szakaszában represszálva lehet, és csak a korai stacioner fázisban, maximális sejtsűrűségnél kapcsoljuk be (depreszáljuk), lehetővé téve a PH05 promoter által kontrollált gén kifejeződését. Ez a tulajdonság, meg a transzkripció magas szintje együtt teszik a PH05 promotert a jelen találmány szerinti előnyös, promoterré. A jelen találmány szerinti hibrid-vektorokban az élesztópromotert működőképesen kapcsoljuk a TPA kódoló szakaszhoz, hogy B 4
