201114. lajstromszámú szabadalom • Eljárás treponema hyodysenteriae bakterin előállítására
5 HU 201114 B b megfelelő vivőközegben szuszpendáljuk a kívánt bakterin előállítása céljából. A bakterin hatékonyságát adjuváns alkalmazásával tovább növelhetjük. A találmány szerinti eljárással előállított T. hyodysenteriae sejtekhez előnyösen alkalmazható adjuváns egy poliallil-szacchariddal térhálósított akrilsav-polimer kombináció és egy speciális emulziós rendszer, amelyet a 3 919 411 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás közöl és igényel. Ilyen adjuvánst Havlogen márkanéven hoz forgalomba a Bayvet Division of Miles Laboratories cég. Úgy találtuk, hogy a fenti módon előállított T. hyodysenteriae bakterint intramuszkulárisan mindössze két intramuszkuláris dózisban, háromhetes időközökkel befecskendezhetjük, s igy a malacoknak sertés-dizentériával szemben mutatott ellenállása jelentős mértékben növelhető. A találmányt az alábbi példákban nemkorlátozó jelleggel részletesen ismertetjük. J. példa Koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciót állítunk elő az alábbi módon. Friss szarvasmarha-szérumot 20-25 °C hőmérsékleten tartunk, és 14,7 g/liter nátrium-citrátot adunk hozzá (így a szérum ionerőssége 0,5-re áll be). Az így kapott oldatot 30 percig keverjük, és a pH értékét 7,0-ra állítjuk 1 n nátronlúg megfelelő mennyiségének a hozzáadásával. A keverékhez finom eloszlású kovasavat adunk 10 g/liter mennyiségben, és az igy kapott pépet 3 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az adszorbeált anyagot tartalmazó kovasavat a folyadékfázistól centrifugálással elkülönítjük, és a folyadékot elöntjük. A kovasavpasztát ezután -20 °C-ra fagyasztjuk, és 2 héten át e hőmérsékleten tartjuk. Utána a fagyasztott pasztát szobahőmérsékleten 48 órán ét felengedni hagyjuk, és a kipréselt folyadékot elöntjük. Ekkor a kovasavpasztát kétszeres térfogatú, (tömeg/térf.-ra vonatkoztatva) 0,85%-os vizes, 0,146 mólos nótrium-klorid oldatban szuszpendáljuk, majd 15 percig enyhén keverjük, és utána legalább 3 órán át ülepedni hagyjuk. A felülúszó folyadékot leszifonozzuk, és elöntjük. Ezt a mosási műveletet kétszer ismételjük, majd a kimosott pasztát kétszeres térfogatú, ionmentesitett vízben szuszpendáljuk, és pH-értékét 1 n nátronlúg hozzáadásával 10,5-re állítjuk. Az igy kapott szuszpenziót szobahőmérsékleten 2 órán át keverjük, s közben a pH értékét mindig 10,5-re szabályozzuk. A keverés leállítása után a szuszpenziót 18 órán át ülepedni hagyjuk, majd a felülúszót szifonnal eltávolítjuk, és szűréssel és centrifugálással tisztítjuk. A kovasavat elvetjük. A derített oldatot ezután ultraszűréssel eredeti térfogatának 20%-ára töményitjük. A koncentrált pH értékét 1 n nátronlúg hozzáadásával 11,2-re állítjuk, és utána a koncentrált anyagot hatszoros térfogatú 0,01 mólos nátrium-karbonát oldattal szemben 11,2 pH-értéken dializáljuk. Ezt követően hatszoros térfogatú, ionmentesitett vízzel szemben dializáljuk. A koncentrátum koleszterin-koncentrációját ismert módszerrel megállapitjuk, majd ultraszűréssel 10 mg/ml koleszterin-koncentrációig töményitjük. Ezután a pH értékét 1 n sósav hozzáadásával 7,6-ra állítjuk, és az így kapott oldatot 80 °C hőmérsékleten 1 órán át melegítjük. Ezután az oldatot szobahőmérsékletre hűtjük, és sterilre szűrjük. A szűrt anyagot tisztított, koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakcióként kapjuk. Fagyasztott T. hyodysenteriae ATCC No. 31212 törzsoltóanyagot oltunk olyan üvegcsövekbe, amelyek 13 ml triptikus szójalevest (Difco Laboratories, 27,5 g/liter), 10% magzati borjúszérumot, 0,5% glükózt, 0,05% L-cisztein-hidrokloridot és 0,25 Mg/ml B12 vitamint tartalmaznak. Ezután a csöveket lezárjuk, és 10 térfogatszázalék hidrogént, 80 térfogatszázalék nitrogént és 10 térfogatszázalék szén-dioxidot tartalmazó anaerob atmoszférában 37 °C hőmérsékleten 72 órán át inkubáljuk. Az igy kapott tenyészetet ezután két csőbe visszük át, amelyek ugyanilyen táptalajt tartalmaznak, és 37 °C-on inkubáljuk 24 órán ét ugyanilyen körülmények között. A csövek tartalmát összegyűjtjük. E gyűjtött, aktív tenyészet 7 ml-es részletét 500 ml térfogatú edényekbe adjuk, amelyek mindegyike 200 ml triptikus szójalevest, 1% élesztőkivonatot, 5% bárányszérumot, 0,5 % glükózt, 0,05% L-cisztein-hidrokloridot és 0,25 Mg/ml B12 vitamint tartalmaz. (A százalékokat tömeg/térfogat-ban adjuk meg). Ezután az edények tartalmát a fentebb leirt anaerob atmoszférában 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk addig, amig zavarossá nem válnak (körülbelül 24 órán át). Az ilyen módon szélesztett tenyészeteket ezután két részletre osztjuk, és mindegyik részt felhasználjuk két 14 literes kísérleti fér mentor egyikének az oltására, amelyek mindegyike 7 liter triptikus szójalevest, 1% élesztőkivonatot, 3% bárányszérumot, 1% glükózt, 0,05% L-cisztein-hidrokloridot és 0,25 Mg/ml B12 vitamint tartalmaz. A fermentorok egyikébe 2,5 térf.% mennyiséget adunk a fentebb leirt módon előállított, koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakcióból. Ezután mindkét fermentort 37 °C-on 44 órán át inkubáljuk a fentebb megadott anaerob atmoszférában. A pH értékét 5 n nátronlúg időnkénti hozzáadásával 6,5-en tartjuk. A fenti inkubálás befejezése után megfelelő mintákat veszünk mindegyik fermentorból, majd a fermentorok tartalmát 0,15 térf.% formaiinnal kezeljük a sejtek inaktiválása céljából. A sejtmintákat mikroszkóposán vizsgáljuk; az összes sejtszámot Petroff-Hauser számolókamrában határozzuk 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
