201114. lajstromszámú szabadalom • Eljárás treponema hyodysenteriae bakterin előállítására
3 HU 201114 B 4 amig az oldat ionerőssége a 0,25-1,0 értéket eléri. E célra más sókat, például nátrium-kloridot, nátrium-foszfátot, kálium-foszfátot, ammónium-szulfátot vagy náLrium-szulfétot is alkalmazhatunk. Az oldható só fenti koncentrációban való hozzáadása növeli a következő lépésben a kovasavon adszorbeált koleszterin mennyiségét. A szarvasmarha-plazmát általában olyan módszerrel gyűjtjük, aminek során antikoagulánsként citrátot adunk hozzá. Az így elért sókoncentráció általában elegendő az adszorpciós lépésben, és további só hozzáadása szükségtelen. A kiinduló anyagként alkalmazott plazmát vagy szérumot 0-50 °C, előnyösen 20- -25 °C hőmérsékleten tartjuk; pH-értékét 5,5-9,0-ra, előnyösen 7,0-8,0-ra állítjuk be. Az eljárás sorén alkalmazható kovasav-adszorbens összetétele nem kritikus. E célra alkalmas kovasav a Cabot Corporation cégtől Cabosil márkanéven beszerezhető, mikrofinomségú kovasav és a Cary Company cégtől Aerosil 380 márkanéven beszerezhető, por alakú kovasav. A kovasavat 2-50 g/liter, előnyösen 10-20 g/liter mennyiségben adjuk a folyékony plazmához vagy szérumhoz. Ezt követően a folyékony plazmával vagy szérummal kapott kovasav-szuszpenziót körülbelül 3-4 órán ót keverjük, majd az adszorbeált koleszterint tartalmazó kovasavat a folyékony plazma vagy szérum többi részétől előnyösen centrifugálással elkülönítjük, és a folyadékfázist elöntjük. Ezután a kovasavpasztát -20 °C-ra hűtjük, és ezen a hőmérsékleten tartjuk legalább egy, előnyösen két hétig. A fagyasztott pasztát ezután 24- -48 órán át szobahőmérsékleten (körülbelül 20-25 °C hőmérsékleten) felengedni hagyjuk, és a fölengedett pasztából kipréselt folyadékot elöntjük. Az így kapott kovasavpasztát a nemkivánt fehérjék eltávolítása céljából mossuk. Ezt úgy végezzük, hogy a pasztát mintegy 0,15 mól/liter nátrium-kloridot tartalmazó, vizes sóoldatban szuszpendáljuk; e helyen nótrium-acetátot vagy nátrium-foszfátot is alkalmazhatunk. A sóoldatot a paszta tömegére vonatkoztatva körülbelül kétszeres menynyiségben alkalmazzuk. A pasztát a folyadéktól elválasztjuk. Ezt a sóoldatos mosási műveletet előnyösen kétszer ismételjük az okkludált fehérjék eltávolítása céljából. A mosott pasztát körülbelül kétszeres térfogatú, ionmentesitett vagy desztillált vízben szuszpendáljuk, és a pH-értéket 9,5-11,5 közé, előnyösen 10,4-10,6 közé állítjuk be megfelelő bázisos anyag, például vizes nétronlúg hozzáadáséval. A szuszpenziót körülbelül 2 órán át keverjük, ez alatt a pH-értékét a fenti bázisos anyag időnkénti hozzáadásával a kívánt szinten tartjuk. Ez a kezelés a kívánt koleszterinfrakciót a kovasavról eluálja. A szuszpenziót ezután 12-24 órán át, előnyösen 12-18 órán át ülepedni hagyjuk. A koleszterint tartalmazó felülúszót további kezelés céljából leszifonozzuk (lehébérezzük). Előnyösen úgy járunk el, hogy csak az első eluólás termékét alkalmazzuk a kívánt, koleszterinben gazdag frakció előállítására. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a fenti alkalikus szuszpendálást, eluálást, keverést és ülepitést két vagy több alkalommal ismételjük, és a második és harmadik eluálásból származó felülúszót az első eluálásból származó termékkel egyesítjük. Ezután a kovasavat elvetjük. A koleszterinoldatot szűréssel, majd centrifugálással mentesítjük a kovasav nyomaitól, majd ultraszűrési eljárással eredeti térfogatának 15-50 százalékára, előnyösen 20 százalékára koncentráljuk. A pH-t 11,0- -11,4, előnyösen 11,2 értékre állítjuk be alkalikus szer hozzáadáséval. Ez az eljárás elősegíti minden visszamaradt kovasav szolubilizálasát és ezt követő eltávolítását. A koleszterin-koncentrátumot ezután olyan módon kezeljük, hogy lényegében valamennyi jelenlévő sót eltávolítsuk. A sók eltávolításának előnyös módszere abban áll, hogy először nátrium-karbonáttal, majd vízzel szemben dialízist végzünk. A só eltávolításának lépése lényeges az ezután következő hőkezelő lépés szempontjából. Ha só marad jelen jelentős mennyiségben, akkor hevítés során a koleszterin nemkivánt denaturálása következik be. A dializált koleszterinoldatot ultraszűréssel tovább koncentráljuk 0,5-30 mg/ml, előnyösen 10-20 mg/ml koleszterin-koncentrációig. Ezután a koncentrált koleszterinoldat pH-értékét 7,0-11,0-ra, előnyösen 7,6-ra állítjuk be, hogy a szaporító táptalajban való felhasználásra a lehető legalkalmasabbá tegyük. Az oldatot 30 perctől 24 óráig terjedő időtartamon át, előnyösen 30-60 percig 50- -100 °C, előnyösen 80 °C hőmérsékleten melegítjük a koleszterin tárolási stabilitásának növelése céljából. Ezután az oldatot szobahőmérsékletre hütjük, és sterilre szűrjük; így tisztított, koleszterinben gazdag frakciót kapunk. Ez a termék nem tiszta koleszterin, hanem azonosítatlan anyagok csekély mennyiségét tartalmazza, amelyek a gyártási folyamaton át kísérik. A tiszta koleszterin a találmány szerinti eljárásban nem alkalmazható, mert nem fejt ki lényeges hatást a T. hyodysenteriae szaporodására olyan módon, mint ahogyan ez koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakció segítségével elérhető. A koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciót tartalmazó táptalajokon a T. hyodysenteriae sejtek a tapasztalt szakember számára jól ismert körülmények között szaporíthatok. Az így kapott sejteket azután közismert módon elöljük, például formalin, mertiolát vagy béta-propiolakton alkalmazásával. Ezt követően a sejteket összegyűjtjük, és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
